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METHOD FOR PRODUCING INTESTINAL ORGANOID DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS

Foreign code F190009760
File No. S2017-0618-C0
Posted date May 7, 2019
Country WIPO
International application number 2018JP017572
International publication number WO 2018207714
Date of international filing May 2, 2018
Date of international publication Nov 15, 2018
Priority data
  • P2017-093418 (May 9, 2017) JP
Title METHOD FOR PRODUCING INTESTINAL ORGANOID DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
Abstract The present invention addresses the problem of producing a functional intestinal organoid from pluripotent stem cells. An intestinal organoid is produced from pluripotent stem cells through the following steps: (1) a step for differentiating the pluripotent stem cells into endoderm-like cells; (2) a step for differentiating the endoderm-like cells obtained in step (1) into intestinal stem cell-like cells; (3) a step for culturing the intestinal stem cell-like cells obtained in step (2) to form a spheroid; and (4) a step for differentiating the spheroid formed in step (3) to form an intestinal organoid, wherein culturing is carried out in the presence of, in addition to an epidermal growth factor, a BMP inhibitor and a Wnt signal activator, a MEK1/2 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGFβ receptor inhibitor and a γ-secretase inhibitor.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Small intestine may be orally administered medicament very important to consider the dynamic body is an organ. In non-clinical trials of drugs in human small intestine (absorption, excretion, metabolism) the kinetics of the small intestine for comprehensively evaluating the primary use of epithelial cells is desirable, this is difficult to obtain. In recent years, as new in vitro evaluation system, and intestinal tissue 3 to mimic the three-dimensional tissue structures are of interest (organoids). However, an embryonic stem cell (embryonic stem cells: ES cells) and in the same manner as ES cells of the almost infinite and multipotent has the ability to propagate, the use of drug discovery is also expected to induced pluripotent stem cell (induced pluripotent stem cells: cell iPS) is differentiated from the induced intestinal organoids and prematurely, the pharmacokinetic analysis is not substantially function.
Also, a non-human mammal and disease model is useful in biomedical research. In particular, in the drug discovery laboratory animal and human monkey used as a very similar in many points, the drug-metabolizing enzyme or transporter homology of the amino acid sequence of the 90-95% was observed, similar substrate specificities. Therefore in the non-clinical trials, as well as in vitro in vivo using Cynomolgous is possible to confirm the correlation, to more accurately predict a human can.
ES cells or iPS cells 2 from the three-dimensional (2D) culture produced by the intestinal epithelium cells (for example Patent Document 1, reference 2), and the like using two-dimensional 3 Matrigel (3D) culture produced by organoids in the gastrointestinal tract (for example, Patent Document 3, 4, Non-Patent Document 1-4) are reported.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 以下の工程(1)~(4)を含む、多能性幹細胞から腸管オルガノイドを作製する方法:
 (1)多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
 (2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
 (3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を培養し、スフェロイドを形成させる工程;
 (4)工程(3)で形成されたスフェロイドを分化させ、腸管オルガノイドを形成させる工程であって、上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下での培養を含む工程。

[請求項2]
 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、請求項1に記載の作製方法。

[請求項3]
 前記多能性幹細胞がヒト又は霊長類の細胞である、請求項1又は2に記載の作製方法。

[請求項4]
 前記多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF4とWntアゴニストの存在下での培養を含む、請求項1に記載の作製方法。

[請求項5]
 前記ヒト人工多能性幹細胞が、腸疾患の患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項4に記載の作製方法。

[請求項6]
 前記多能性幹細胞がカニクイザル人工多能性幹細胞であり、工程(2)がFGF2とGSK-3阻害剤の存在下での培養を含む、請求項1に記載の作製方法。

[請求項7]
 工程(3)の培養において、均一な形状及び大きさの複数のウェルが細胞低接着性又は細胞非接着性の培養面に形成された培養容器を使用し、複数のスフェロイドをまとめて形成させる、請求項1~6のいずれか一項に記載の作製方法。

[請求項8]
 BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin-1である、請求項1~7のいずれか一項に記載の作製方法。

[請求項9]
 MEK1/2阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、γ-セクレターゼ阻害剤がN-[(3,5-difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenyl-1,1-dimethylethyl ester-glycineである、請求項1~8のいずれか一項に記載の作製方法。

[請求項10]
 水溶液中に3次元的網目構造を形成する材料を添加した液体培地を工程(4)の培養に用い、工程(3)で形成させた複数のスフェロイドがまとめて浮遊培養される、請求項1~9のいずれか一項に記載の作製方法。

[請求項11]
 前記材料が高分子ゲル及び多糖からなる群より選択される一以上の材料である、請求項10に記載の作製方法。

[請求項12]
 前記材料が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項10に記載の作製方法。

[請求項13]
 工程(4)の培養期間が12日間~36日間である、請求項1~12のいずれか一項に記載の作製方法。

[請求項14]
 工程(4)が、以下の工程(4-1)と工程(4-2)を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の作製方法:
 (4-1)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤の存在下で培養する工程;
 (4-2)上皮成長因子、BMP阻害剤及びWntシグナル活性化剤に加えて、MEK1/2阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びγ-セクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程。

[請求項15]
 工程(4-1)の培養期間が3日間~15日間であり、工程(4-2)の培養期間が3日間~21日間である、請求項14に記載の作製方法。

[請求項16]
 請求項1~15のいずれか一項に記載の作製方法で得られた腸管オルガノイド。

[請求項17]
 請求項16に記載の腸管オルガノイドを用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。

[請求項18]
 前記体内動態が、代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項17に記載の評価方法。

[請求項19]
 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項18に記載の方法:
 (I)請求項16に記載の腸管オルガノイドに被検物質を接触させる工程;
 (II)被検物質の代謝、吸収性、膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導、或いは毒性を測定・評価する工程。

[請求項20]
 請求項16に記載の腸管オルガノイドを含む、移植材料。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NAGOYA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • MATSUNAGA Tamihide
  • IWAO Takahiro
  • ONOZATO Daichi
  • OGAWA Isamu
IPC(International Patent Classification)
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