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DNA PRODUCTION METHOD AND DNA FRAGMENT JOINING KIT

Foreign code F190009779
File No. (IP14P004)
Posted date May 7, 2019
Country WIPO
International application number 2018JP025528
International publication number WO 2019009361
Date of international filing Jul 5, 2018
Date of international publication Jan 10, 2019
Priority data
  • P2017-132084 (Jul 5, 2017) JP
  • P2017-231732 (Dec 1, 2017) JP
Title DNA PRODUCTION METHOD AND DNA FRAGMENT JOINING KIT
Abstract The present invention provides: a method that makes it possible to produce straight-chain or annular DNA by the joining of two or more types of DNA fragments at regions that have homologous base sequences; and a DNA fragment joining kit that uses said method. The present invention is a DNA production method that involves: preparing a reaction solution that includes two or more types of DNA fragments and a protein that acts as a RecA-family recombination enzyme; and producing straight-chain or annular DNA in the reaction solution by causing the two or more types of DNA fragments to be joined at regions that have homologous base sequences or regions that have complementary base sequences.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
A plurality of linear DNA fragments were ligated to the 2 single-stranded, linear or cyclic double-stranded DNA 2 is a method of producing. According to the method, chemical synthesis is a more difficult to synthesize a long-chain 2-stranded DNA can be obtained. 2 Stranded DNA fragments were ligated linear method is, primarily, In fusion method (see Patent Document 1.) And Gibson Assembly method (see Patent Document 2 and Patent Document 3.) Is present.
In fusion method, each end of the stranded DNA fragments 2 15 base sequence homologous to the recognition function that fuzes the coupling reaction using an enzyme In fusion is a method. Specifically, first, by using PCR, DNA fragments of 2 for the purpose of the present chain is connected to the end of the same nucleotide sequence of the homologous region is added. At both ends of the homologous region of the base 15 is added to each of the stranded DNA fragments 2 2 can be mixed and incubated In fusion enzymes can be linked by.
On the other hand, Gibson Assembly method, first, the first distal region 1 of the first DNA molecule DNA molecule 2 of the proximal region of the enzymes with exonuclease activity, the same area of each of the (mutually-specific hybridization of a sufficient length of the region of sequence identity) 1 and the single-stranded state. Then, both the anneal after the couple, to repair a nick and a gap, a complete DNA strand 2 to obtain the connecting body. For example, to Patent Document 2, 1.6kbp and 2 of the double-stranded DNA fragments 1.4kbp, T4 DNA was digested with exonuclease activity of the polymerase comprises a stranded state 1 and then, after coupled in the presence of RecA, dNTP and T4 DNA DNA ligase was added and this fills the gap in the polymerase activity to repair the nick, double-stranded DNA of 3kbp 2 as described was obtained.
Other, using 2 linear RecA DNA strand as a method of concatenating a plurality of fragments, in Patent Document 4, or recombinant polypeptide of the recombinant enzyme family RecA protein activity in the presence of, a plurality of linear DNA single-stranded DNA fragment 2 can be incubated with a ligase, a plurality of linear DNA fragments 2 are coupled in series is double-stranded linear DNA strand 2 have been disclosed methods for making the same. In this method, the recombinant enzyme family RecA the like is used, the stranded DNA fragment 2 of a linear combination of both ends is suppressed, and, single-stranded DNA fragments between the linear 2 to facilitate the coupling of the terminal.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 2種類以上のDNA断片と、RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質と、を含む反応溶液を調製し、
 前記反応溶液中で、前記2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得る、DNAの産生方法。

[請求項2]
 前記反応溶液が、さらにエキソヌクレアーゼを含む、請求項1に記載のDNAの産生方法。

[請求項3]
 前記エキソヌクレアーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼである、請求項2に記載のDNAの産生方法。

[請求項4]
 前記反応溶液が、さらに、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼを含む、請求項1に記載のDNAの産生方法。

[請求項5]
 前記反応溶液が、さらに、直鎖状2本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼと1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼとを含む、請求項1に記載のDNAの産生方法。

[請求項6]
 前記反応溶液が、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素及びその基質を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項7]
 前記再生酵素がクレアチンキナーゼであり、前記基質がクレアチンリン酸である、
 前記再生酵素がピルビン酸キナーゼであり、前記基質がホスホエノールピルビン酸である、
 前記再生酵素がアセテートキナーゼであり、前記基質がアセチルリン酸である、
 前記再生酵素がポリリン酸キナーゼであり、前記基質がポリリン酸である、又は
前記再生酵素がヌクレオシドジフォスフェートキナーゼであり、前記基質がヌクレオシド三リン酸である、請求項6に記載のDNAの産生方法。

[請求項8]
 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液は、マグネシウムイオン源濃度が0.5~15mMであり、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の濃度が1~1000μMである、請求項1~7のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項9]
 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応を、25~48℃の温度範囲内で行う、請求項1~8のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項10]
 7個以上のDNA断片を連結させた直鎖状又は環状のDNAを得る、請求項1~9のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項11]
 前記反応溶液は、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項12]
 前記反応溶液は、ポリエチレングリコール、アルカリ金属イオン源、及びジチオスレイトールからなる群より選択される1種以上を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項13]
 前記RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質がuvsXであり、前記反応溶液はさらにuvsYを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項14]
 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、前記DNA断片の末端又はその近傍に存在する、請求項1~13のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項15]
 前記塩基配列が相同である領域又は前記塩基配列が相補である領域が、10bp以上500bp以下の長さである、請求項14に記載のDNAの産生方法。

[請求項16]
 前記2種類以上のDNA断片を連結させる反応の開始時点における前記反応溶液が、モル濃度が互いに等しい2種類以上のDNA断片を含有する、請求項1~15のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項17]
 連結により得られた直鎖状又は環状のDNA中のギャップ及びニックをギャップリペア酵素群により修復する、請求項1~16のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項18]
 連結により得られた直鎖状又は環状のDNAを50~70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後、ギャップリペア酵素群により修復する、請求項17に記載のDNAの産生方法。

[請求項19]
 ギャップ及びニックが修復された直鎖状又は環状の2本鎖DNAを増幅させる、請求項17又は18に記載のDNAの産生方法。

[請求項20]
 連結により得られたDNAが直鎖状であり、
 当該直鎖状DNAを直接鋳型として用いてPCRを行う、請求項1~16のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項21]
 連結により得られたDNAが、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列を含む環状DNAであり、
 当該環状DNAと、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群と、岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群と、2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群と、dNTPと、を含む反応混合物を形成し、形成された反応混合物を等温条件下でインキュベートすることにより、前記環状DNA中のギャップ及びニックの修復、並びに増幅を行う、請求項1~16のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項22]
 連結により得られたDNAを、予め50~70℃で熱処理し、続いて10℃以下に急冷した後に前記反応混合物を形成させる、請求項21に記載のDNAの産生方法。

[請求項23]
 連結により得られた直鎖状又は環状のDNAを微生物に導入し、当該微生物内で、前記DNA中のギャップ及びニックが修復された2本鎖DNAを増幅させる、請求項1~16のいずれか一項に記載のDNAの産生方法。

[請求項24]
 2種類以上のDNA断片を、塩基配列が相同である領域同士又は塩基配列が相補である領域同士において互いに連結させて直鎖状又は環状のDNAを得るためのキットであって、
 RecAファミリー組換え酵素活性をもつ蛋白質を含むDNA断片連結用キット。

[請求項25]
 さらに、エキソヌクレアーゼを含む、請求項24に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項26]
 前記エキソヌクレアーゼが3’→5’エキソヌクレアーゼである、請求項25に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項27]
 さらに、直鎖状2本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項24に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項28]
 さらに、直鎖状2本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼと1本鎖DNA特異的3’→5’エキソヌクレアーゼとを含む、請求項24に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項29]
 さらに、ヌクレオシド三リン酸又はデオキシヌクレオチド三リン酸の再生酵素、及びその基質を含む、請求項24~28のいずれか一項に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項30]
 さらに、塩化テトラメチルアンモニウム及びジメチルスルホキシドからなる群より選択される1種以上を含む、請求項24~29のいずれか一項に記載のDNA断片連結用キット。

[請求項31]
 さらに、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド三リン酸、マグネシウムイオン源、アルカリ金属イオン源、ポリエチレングリコール、ジチオスレイトール、及び緩衝液からなる群より選択される1種以上を含む、請求項24~30のいずれか一項に記載のDNA断片連結用キット。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • SUETSUGU Masayuki
  • KURATA Tatsuaki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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