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CELL PROLIFERATION DETECTION METHOD USING FLUORESCENCE IN WATER-IN-OIL EMULSION CULTURING commons

Foreign code F190009840
File No. (2017002067)
Posted date Jul 25, 2019
Country WIPO
International application number 2018JP037257
International publication number WO 2019073902
Date of international filing Oct 4, 2018
Date of international publication Apr 18, 2019
Priority data
  • P2017-197980 (Oct 11, 2017) JP
Title CELL PROLIFERATION DETECTION METHOD USING FLUORESCENCE IN WATER-IN-OIL EMULSION CULTURING commons
Abstract The present invention addresses the problem of providing a method which enables the noninvasive detection and isolation of droplets in which microorganisms have proliferated. The present invention relates to a detection method for detecting the proliferation of microorganisms within droplets, the method including (a) a step for producing droplets which include microorganisms, (b) a step for culturing the microorganisms within the droplets, and (c) a step for detecting proliferation of the microorganisms within the droplets, in which (c1) a fluorescent modified nucleic acid probe, which acts on a substance secreted or discharged from the microorganisms and emits fluorescence, is used, and fluorescence emitted by the fluorescent modified nucleic acid probe is measured or (c2) the autofluorescence of the microorganisms is measured, wherein the droplets in which fluorescence was detected include intact microorganisms.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Into the environment and various organisms, we have produced by the microorganism or microorganisms these materials have been used. However, in the environment 99% is not yet successful culture, many of the resources of the organism remains untouched. These can be the unknown microorganism is cultured, a physiological characteristic of the microorganisms in the environment as well as a clear, medical, the development in the industry is expected to be applied. In recent years, separation of the microorganisms, as one of the culture, the method using the emulsion W/O being of interest (non-patent document 1 and Non-Patent Document 2). In this manner, the water in the oil phase (microbial culture medium used) is dispersed, each of the droplets (droplet) is used as one of the culture field. By using the micro-channels, several hundred thousand to several tens of minutes-several hundred million units of the droplet can be manufactured and high throughput can be expected. In addition, the number of microorganisms present in the aqueous phase by adjusting the number of droplet, the droplets enclosed in one cell can be produced, from a single cell culture is enabled (non-patent document 3). When culturing a microorganism utilizing this approach, the number of cells per one droplet 1 according to the Poisson distribution. 1 Enters the one cell to one of the droplet increases the probability of the substrate increases, there is no probability of occurrence of microbes of the droplet increases. At this time, it can be seen that the growth of microorganisms selectively droplet as long as the sorting of each microorganism analysis, can be used to scale up and the like. The detection of microorganisms in the droplet present in the cell reacts with the substrate fluorescence have been used, these cells are disrupted at the same time is required because, while living microorganisms cannot be taken out (non-patent document 4, Non-Patent Document 5).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、
(a)微生物を含むドロップレットを作製する工程と
(b)前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
(c)前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光特性の変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と
を含み、
 蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法。

[請求項2]
 請求項1に記載の検出方法であって、
 前記(c)の検出工程における前記蛍光修飾核酸プローブが前記微生物より体外に分泌または放出されたRNaseまたはDNaseの作用により蛍光特性に変化を生じるものである、検出方法。

[請求項3]
 請求項1または2に記載の検出方法であって、
 前記(c)の検出工程がマイクロ流路上で行われる、検出方法。

[請求項4]
 請求項1~3のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記微生物が環境由来である、検出方法。

[請求項5]
 請求項1~4のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記微生物が人工的に作製されたものではない、検出方法。

[請求項6]
 請求項1~3のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記微生物が遺伝子組換え微生物である、検出方法。

[請求項7]
 請求項1~6のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記(a)ドロップレットを作製する工程が、二種以上の微生物を含むドロップレットを作製する工程である、検出方法。

[請求項8]
 請求項1~7のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記(a)ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレットを作製する工程であって、
 前記(c)の検出工程において蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物を含むものである、検出方法。

[請求項9]
 請求項1~8のいずれか一項に記載の検出方法であって、
 前記(c)の検出工程において前記蛍光修飾核酸プローブは、
(ア)前記(a)のドロップレットの作製工程において、ドロップレット中に封入されるか、または、
(イ)前記(c)の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させることにより、微生物を含むドロップレット中に封入される、検出方法。

[請求項10]
 請求項9に記載の検出方法であって、
 前記蛍光修飾核酸プローブがFRET型蛍光修飾核酸プローブである、検出方法。

[請求項11]
 W/Oエマルションからインタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットを回収する方法であって、
(i)微生物を含むドロップレットを作製する工程と
(ii)前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
(iii)前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
  前記微生物より分泌または放出された物質に作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
  微生物の自家蛍光を測定する工程と
(iv)蛍光特性の変化を検出したドロップレットを回収する工程と
を含む、回収方法。

[請求項12]
 請求項11に記載の回収方法であって、
 前記(iii)および(iv)の工程をさらに1回または複数回繰り返す、回収方法。

[請求項13]
 請求項11または12に記載の回収方法であって、前記(iv)の回収工程の後に
(v)前記ドロップレットから微生物を回収することを含む、回収方法。

[請求項14]
 請求項1~10のいずれか一項に記載の検出方法、または、請求項11~13のいずれか一項に記載の回収方法に使用されるキットであって、
 W/Oエマルション水相用の培養液と
 W/Oエマルション油相用の油成分と
 W/Oエマルションを安定化するための界面活性剤と
 蛍光修飾核酸プローブと
を含む、キット。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
  • Inventor
  • OOTA Yuri
  • SAITO Kanako
  • TAKAGI Taeko
  • TSUNEDA Satoshi
  • MIYAMOTO Tatsuki
  • MORITA Masamune
  • MATSUKURA Satoko
  • NODA Naohiro
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
Reference ( R and D project ) Biomedical Research Institue,Bioanalytical Research Group

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