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MODIFIED COLLAGEN PROTEIN AND APPLICATION OF SAME

Foreign code F190009865
File No. (S2018-0110-N0)
Posted date Jul 26, 2019
Country WIPO
International application number 2018JP042181
International publication number WO 2019098246
Date of international filing Nov 14, 2018
Date of international publication May 23, 2019
Priority data
  • P2017-219515 (Nov 14, 2017) JP
Title MODIFIED COLLAGEN PROTEIN AND APPLICATION OF SAME
Abstract In order to develop tools and methods useful in a variety of applications, including the research and development of medical treatments which involve the modification of collagen protein and use of the same, the present invention provides a modified collagen protein expressed in a transformed cell and capable of forming collagen fibers outside of said cell, wherein the transformation is performed by introducing, into the cell, into the cell, polynucleotides coding the modified collagen protein.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Tissue fibrosis is, accompanied by inflammation and wound healing damage becomes excessive, the tissue is generated to replace the normal tissue, causing deterioration in the functioning of organs and tissues (for example, in the lung interstitial pneumonia, infection, pneumonia etc. (smoking can cause); in the liver, liver or the like (viral infection, alcohol and the like can cause); in the kidney is, diabetes stage or the like; in the heart, such as heart failure; or post-operative adhesions and the like). Particularly likely to occur on the end of a variety of diseases, which is the main cause of organ failure. The analysis of these occurrences, the experimental animal anatomy (i.e., invasive method) in a series of analysis is necessary.
In the prior art, N or C terminus is at the end of the collagenous proteins are secreted outside when the cutting, is removed, a long central portion of the collagen polypeptide (amount of the helix portion 3) for only contributes to the formation of fibers, such as N or C terminus is added at the end of imaging is a fluorescent protein, cannot be detected only in the cells transporting, after cutting out the cells at the time of the collagen fibers was impossible to visualize.
In addition, fibers 3 are involved in the formation amount of the helix portion and the stored portion among species, structurally stable, this portion of the other protein it was difficult to insert. (Fig. 1; Non-Patent Document 1: Prockop DJ et al., New Engl J Med, Vol.301, 13-23, 1979) therefore, typical fusion protein in the method of labeling may be difficult.
Fibrosis is a component of Type I, III, V, among collagen XI, XI collagen TypeV and exceptionally has N-terminal domain is not cut, in particular, such as a set of Type I collagen when forming thicker fibers, fibrillar collagen Type V N-terminal domain and the outside of the considered (Fig. 2; Non-Patent Document 2: Simone M. Smith and David E. Birk, Exp Eye Res Vol.98, 105-106, 2012)
Human, and human collagen expression vector, the manufacturing method of the collagen, in the patent literature have been reported (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open 08-023979). In this document, it is the full-length genes collagen type 3 human integrated into the vector expression has been reported, the correct protein is synthesized on the electrophoresis as is, the original form of the collagen fibers outside of the cell whether or not will be described. sf9 Cells primarily produce other types of collagen is not, the cell with the correct formation of collagen fibers will not be able to appear. In addition, the probe and its use in the method for tissue analysis report may be in the literature (Japanese Patent Laid-Open 2:WO2012/124338). In this patent, collagen-binding domain of collagenase and a fluorescent protein is added to the probe is disclosed.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 形質転換細胞で発現され、前記細胞外にてコラーゲン線維を形成することができる改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記形質転換が、前記改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの前記細胞への導入によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項2]
 請求項1に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記改変が、前記コラーゲンをコードするヌクレオチド配列への前記コラーゲンとは異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入または付加によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項3]
 前記挿入または付加が、コラーゲンタンパク質のN末端側またはC末端側の領域に対応する領域内の部位においてなされたものである、請求項1または2に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項4]
 前記コラーゲンとは異なるタンパク質が、標識用タンパク質および治療用タンパク質からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項5]
 前記標識用タンパク質が、蛍光タンパク質(例:GFP、iRFP、HaloTag7)または発光タンパク質(例:ルシフェラーゼ(遺伝子例:Luc(+), Luc2、CBGluc、CBRluc、ELuc、SLR、SLO、SLG))であり、前記治療用タンパク質が、抗体または特殊ペプチドである、請求項4に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項6]
 前記コラーゲンが、Type VコラーゲンまたはType XIコラーゲンである、請求項1~5のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項7]
 前記コラーゲンが、Type V α1、Type V α3、Type XI α1、またはType XI α2コラーゲンである、請求項6に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項8]
 請求項1~7のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたコラーゲンタンパク質。

[請求項9]
 請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

[請求項10]
 配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項9に記載のポリヌクレオチド。

[請求項11]
 請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

[請求項12]
 請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、または請求項11に記載の発現ベクターが導入された発現細胞株。

[請求項13]
 請求項12に記載の発現細胞株をコートしたコラーゲンコートディッシュ。

[請求項14]
 請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチドを含む薬物送達ビヒクル。

[請求項15]
 請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。

[請求項16]
 請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載の発現ベクター、請求項12に記載の発現細胞株、請求項14に記載のビヒクル、または請求項15に記載の組成物が導入されたモデル動物。

[請求項17]
 前記モデル動物がマウスである、請求項16に記載のモデル動物。

[請求項18]
 改変されたコラーゲンをコードする遺伝子を形質導入した細胞の細胞外において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
 請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む、方法。

[請求項19]
 形質導入された前記細胞をインビトロでストレス下で培養する工程を含む、請求項18に記載の方法。

[請求項20]
 モデル動物において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる工程をさらに含む、請求項18または19に記載の方法。

[請求項21]
 前記改変されたコラーゲンタンパク質が、標識用タンパク質の挿入または付加により改変されており、
 前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程をさらに含む、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。

[請求項22]
 前記改変されたコラーゲンが、N末端ドメインとヒンジ部位との間の部位に標識用タンパク質を挿入したType Vコラーゲンα1である、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。

[請求項23]
 コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成の阻害剤のスクリーニング方法であって、
 請求項12に記載の発現細胞株をインビトロでストレス条件下で培養する工程であって、改変されたコラーゲンタンパク質が標識用タンパク質の挿入または付加により改変されている、工程、
 前記ストレス条件下での培養の前に、前記培養物に前記阻害剤の候補物質を添加する工程、ならびに
 前記候補物質の前記添加後、前記培養物において、前記細胞の細胞外においてコラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を観察し、前記コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を、前記候補物質の前記添加がなかった場合と比較して低減させる作用を有する前記候補物質を前記阻害剤として選択する工程を含む、方法。

[請求項24]
前記選択する工程が、前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程を含む、請求項23に記載の方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • UNIVERSITY OF TSUKUBA
  • Inventor
  • MIWA Yoshihiro
  • KIJIMA Junko
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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