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ヘリカーゼを用いたPCR 新技術説明会

Patent code P180015652
File No. 5458
Posted date 2018年11月22日
Application number 特願2016-147582
Publication number 特開2018-014924
Patent number 特許第6853523号
Date of filing 平成28年7月27日(2016.7.27)
Date of publication of application 平成30年2月1日(2018.2.1)
Date of registration 令和3年3月16日(2021.3.16)
Inventor
  • 保川 清
  • 藤原 伸介
  • 柳原 格
  • 名倉 由起子
Applicant
  • 国立大学法人京都大学
  • 学校法人関西学院
  • 地方独立行政法人大阪府立病院機構
Title ヘリカーゼを用いたPCR 新技術説明会
Abstract 【課題】擬陽性を抑制することにより正確性を高めたデジタルPCRの方法の提供。
【解決手段】ヘリカーゼを含有したPCRミックスデタルPC用に0.1~500nLに分注され、ヘリカーゼ濃度が、10nM以下である、PCRキット。
【選択図】なし
Outline of related art and contending technology

デジタルPCRは、各サンプル中の核酸の初期量を測定する際に、増幅サイクル数に依存することなく絶対定量やレアな対立遺伝子の検出を行うことができる手法として、近年注目を集めており、例えば、遺伝子検査、特に、CNV(コピー数多型)解析、Rare sequence検出、遺伝子発現解析などのアプリケーションに有用であると考えられている。デジタルPCR関連の研究開発も精力的に進められている(例えば特許文献1~3)。

デジタルPCRでは、例えば、核酸サンプル(例えば、DNAやcDNA等のターゲット核酸を含むサンプル)を必要に応じて希釈したうえで多数のウェルに分配し、個々のウェルで(同時並行に)PCRを行う。このとき、1つあるいは複数のターゲット分子を含むウェルもあれば、ターゲット分子を全く含まないウェルも存在する。PCR終了後にウェル毎にPCR増幅の有無を解析し、増幅があったウェルはターゲット分子が入っていたポジティブ反応として、増幅がなかったウェルはターゲットを含まないネガティブ反応として数をカウントする。このようにして、PCR後に各ウェルのシグナルの有無を検出することで、ポジティブ反応及び/又はネガティブ反応の割合を基に、サンプル中のターゲット分子の絶対定量が可能となる。スタンダードやコントロールサンプルとの比較は必要ない。なお、サンプル中のターゲット分子はランダムに分配されるため、ポジティブ反応とされたウェルに、1分子のみ分配されたという確証はない。そこで、ターゲット核酸が複数分配された可能性のあるウェルを算出するため、統計学的処理(例えばポアソンモデルを用いた処理)により、補正係数を適用し、ターゲット核酸の絶対数を算出することができる。

このように、デジタルPCRでは、ウェルにおいて核酸増幅が起こるか起こらないかでターゲット核酸の絶対定量を行う技術であるため、擬陽性(すなわちターゲット核酸を含まないウェルで増幅(例えば非特異的増幅)が見られること)が存在すると、その正確性が大きく損なわれるおそれがある。特に、反応液の容量が大きい(例えば1μL以上)場合には、反応液を電気泳動にかけて増幅産物のバンドを解析することにより、そのバンドが特異的増幅産物であるか非特異的増幅産物であるかを判断できるが、デジタルPCRのように反応液の容量が小さい(例えば1μL未満)場合には、そのような解析ができないため、特に高い正確性及び反応効率が要求される。従って、デジタルPCRのような反応液容量が小さいPCRにおいて、出来る限り正確性を高めるために擬陽性を抑制することが求められている。

Field of industrial application

本発明は、ヘリカーゼを用いたPCRに関する。

Scope of claims 【請求項1】
0.05~500nLに分注された、ヘリカーゼ含有PCRミックスであり、
前記ヘリカーゼ濃度が100nM以下であり、
前記ヘリカーゼが、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヘリカーゼであるTK0566及び配列番号2に示すアミノ酸配列からなるヘリカーゼであるTK0178並びにこれらのアミノ酸配列と同一性が90%以上であってヘリカーゼ活性を有する改変体よりなる群より選択される、少なくとも1種である、
PCRミックス

【請求項2】
デジタルPCR用である、請求項1に記載のPCRミックス

【請求項3】
前記ヘリカーゼ濃度が5~75nM以下である、請求項1又は2に記載のPCRミックス

【請求項4】
0.1~100nLに分注された、請求項1~3のいずれかに記載のPCRミックス。

【請求項5】
請求項1~のいずれかに記載のPCRミックスを備える、又は、請求項1~のいずれかに記載のPCRミックスを調製するための、PCRキット。

【請求項6】
請求項1~のいずれかに記載のPCRミックスを用いて、PCRにより核酸を増幅する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right 登録
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