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HIGHLY-SENSITIVE QUICK MEASURING METHOD OF VASCULAR PERMEABILITY OF ANIMAL

Patent code P05A007504
File No. 測定・分析-67
Posted date Sep 21, 2005
Application number P2003-287673
Publication number P2005-055344A
Patent number P4119981
Date of filing Aug 6, 2003
Date of publication of application Mar 3, 2005
Date of registration May 9, 2008
Inventor
  • (In Japanese)八巻 幸二
  • (In Japanese)石川 祐子
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title HIGHLY-SENSITIVE QUICK MEASURING METHOD OF VASCULAR PERMEABILITY OF ANIMAL
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for measuring quickly and highly sensitively vascular permeability of an animal (excluding human), especially a rodent, and a measuring method of the vascular permeability of the animal (excluding human), especially the rodent, requiring a small quantity of use of an organic solvent, and not using a material having restriction on its custody/use.
SOLUTION: In this method, serum albumin labeled by a fluorescent pigment is used as an index of extravascular permeation of a plasma component, and warming dipping of the skin of a collected measuring part is performed by formamide, and the vascular permeability of the animal (excluding human) is measured quickly and highly sensitively by direct measurement using a fluorescent plate reader.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


食品のアレルギー・炎症の抑制効果を明らかにするにあたり、炎症によって惹き起こされる血漿成分の血管外漏出を測定し、血管透過性の多寡を検討することは効果的な手法である。



従来、例えば齧歯類の血管透過性の測定は、一般に図1に示すような手順で、染色色素を用いて行われていた(例えば、非特許文献1参照)。



即ち、まずダイレクトブルー(もしくはエバンスブルー)色素を齧歯類の尾静脈より投与する。
次いで、予め剃毛した背部皮膚に起炎剤を皮内投与する。
30分ほど経過し、齧歯類を屠殺した後、血液及び起炎剤等を投与した部分の皮膚を切り取り採取する。切り取り採取した皮膚からなる試験片を細断し、ガラス試験管にとり、アルカリで加水分解する。
一晩放置後、リン酸でアルカリを中和し、アセトンで色素を抽出する。血液及び皮膚から抽出した色素量を分光光度計により測定し、血漿漏出量として算出する。



しかしながら、これまで齧歯類の血管透過性を測定するために用いられてきた、このような染色色素による方法は、ダイレクトブルー(もしくはエバンスブルー)色素を皮膚から抽出する操作に時間がかかり、さらに色素抽出用に大量のアセトンを必要とし、色素が希釈されてしまうことから、感度が低いものであった。
また、加水分解のためと、その中和にアルカリ及び酸を使用するため、取扱いに注意が必要であると共に、有機溶媒の使用量が多いため、環境負荷が高いという問題があった。
さらに、指標として用いるダイレクトブルー色素は、強度の変異原性があるとして、第二種指定化学物質に指定されているものであり、保管・使用に制限がある。



このように、これまで動物(但し、ヒトを除く)、特に齧歯類の血管透過性を測定するために用いられてきた染色色素による方法は、感度が低く、また多くの時間を必要としたため、より感度が高く、かつ迅速な測定法の開発が求められていた。さらに、有害な物質の使用を最低限に抑えた測定法の開発が求められていた。



【非特許文献1】
Ishida H. et al.;Br. J. Pharmacol. 130, 1235(2000)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、動物(但し、ヒトを除く)の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
蛍光色素でラベルした血清アルブミンを血漿成分の血管外透過の指標として用い、これを動物(但し、ヒトを除く)に投与した後、測定部の皮膚を採取し、次いで、採取した測定部の皮膚からなる試験片を培養プレートの底に貼り付け、ホルムアミドを加えて加温浸漬した後、蛍光プレートリーダーを用いて、前記培養プレートの底に貼り付けられた前記試験片の蛍光値を直接測定することを特徴とする、動物(但し、ヒトを除く)の血管透過性を高感度かつ迅速に測定する方法。

【請求項2】
 
ホルムアミドでの加温浸漬を、0.5~2mlのホルムアミドを加え、40~60℃で1~3時間程度浸漬することにより行う請求項1記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2003287673thum.jpg
State of application right Registered


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