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METHOD AND APPARATUS FOR PREPARING GENOME PHYSICAL MAP

Patent code P05A007520
File No. 植物バイオ-185
Posted date Sep 21, 2005
Application number P2003-341476
Publication number P2005-102614A
Patent number P4581076
Date of filing Sep 30, 2003
Date of publication of application Apr 21, 2005
Date of registration Sep 10, 2010
Inventor
  • (In Japanese)大谷 敏郎
  • (In Japanese)山本 公子
  • (In Japanese)杉山 滋
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title METHOD AND APPARATUS FOR PREPARING GENOME PHYSICAL MAP
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method and an apparatus for preparing a genome physical map in which position information is recovered by directly positioning a library clone and a marker on a chromosome in a pachytene stage in high resolution by SNOM (scanning near-field optical microscopy).
SOLUTION: Light exciting a marker labeled with a fluorescent dye is irradiated from the top of a search needle 1 and fluorescence from a sample is collected through an objective lens 4 and detected in a detector 5. The profile of a sample surface and fluorescent image are acquired by two-dimensionally scanning a positioning mechanism 3 in an XY direction, and fluorescent label on the sample can be detected by ≤0.5 μm revolving power. The signal of the detected fluorescent label is fed to a controller used by combining a controlling apparatus with a signal-analyzing apparatus, and the position on the chromosome of the fluorescent label and shape data of the chromosome are analyzed and relative position relationship or absolute position of the marker on the chromosome is determined by the controller 6 to prepare the genome physical map.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


従来、一般に行われている物理地図の作成手順を以下に示す。
まず、対象生物の組織から全ゲノムDNAを抽出し、細かく断片化し、BAC(bacterial artificial chromosome)やYAC(yeast artificial chromosome)などのベクターにクローニングしてゲノムDNAライブラリーを作成する。次に、ライブラリーに含まれるクローンを何種類かの制限酵素によって切断し、切断サイトのクローン上の位置を決定して制限酵素地図を作成する。その後、各クローンの間で制限酵素地図を比較し、その切断パターンの解析から隣り合うクローンを決定する(フィンガープリント法)。複数のクローンについて隣接関係を特定し、ある程度の長さの領域をカバーするクローンのグループをコンティグと呼ぶ。
この作業と並行して、遺伝地図を参照して、得られたコンティグを染色体上に位置付ける。マーカーのうち配列情報を有するものを利用し、その塩基配列をもとにPCRプライマーないしハイブリダイゼーションプローブを作成して、ライブラリーの中から、そのマーカーの配列を有するものを特定する。あるコンティグに含まれるクローンのひとつが、このようにして染色体上に位置づけられれば、そのコンティグそのものの染色体上の位置も明らかになる。
以上の作業を繰り返して、染色体のほぼ全域にコンティグを位置づけることができれば物理地図が完成する。
一方、近接場光プローブ顕微鏡(Scanning Near-field Optical Microscopy、SNOM)を用いて染色体にハイブリダイズさせた蛍光標識を観察した例は、J. Microsc. 182, 40-45 (1995)やJ. Microsc. 209, 22-33 (2003)などこれまでに少数があるが、いずれも染色体上に数百から数万ヶ所存在する反復配列を対象としており、ゲノムライブラリークローンや遺伝子マーカー(原則的に染色体上に1ヶ所のみ存在)の計測は行った例はない。また、従来例の計測分解能は300nm程度と低く、本発明に必要とされる条件を満たしていない。さらに、これまでに、ハイブリダイズした蛍光シグナルの位置と染色体形状の比較解析からゲノム上の物理位置を算出するような試みはいっさい行われていない。



【非特許文献1】
J. Microsc. 182, 40-45 (1995)
【非特許文献2】
J. Microsc. 209, 22-33 (2003)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、SNOM/AFMを用いて真核生物のゲノム物理地図を作成する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
真核生物のゲノム物理地図を作成する方法であって、
真核生物由来のDNA断片を蛍光標識する工程、
蛍光標識した該DNA断片を、該真核生物から調製した染色体上のDNAとハイブリダイゼーションさせる工程、及び
ハイブリダイゼーションされた蛍光標識DNAの染色体上の位置を、0.5μm以下の分解能で検出する工程、
を含み、
前記検出工程を、近接場光プローブ顕微鏡を用いて行う、
前記ゲノム物理地図作成方法。

【請求項2】
 
前記真核生物由来のDNA断片が、該真核生物から抽出したゲノムDNAを断片化し、断片化したゲノムDNAをクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより作成したゲノムDNAライブラリーに含まれるクローンである、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。

【請求項3】
 
前記真核生物由来のDNA断片が、該真核生物由来の遺伝子配列、cDNA、あるいは既知のゲノム塩基配列情報により人工的に合成されたDNA、または、既知のゲノム塩基配列あるいはランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして該真核生物のゲノムDNAからPCRにより増幅したDNAである、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。

【請求項4】
 
前記染色体が、分裂期染色体またはパキテン期染色体である、請求項1記載のゲノム物理地図作成方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2003341476thum.jpg
State of application right Registered


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