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UTILIZATION OF DNA ENCODING KYNURENINE OXIDASE GENE OF SILKWORM

Patent code P05A007529
File No. 動物バイオ-94
Posted date Sep 21, 2005
Application number P2003-387764
Publication number P2005-143428A
Patent number P4431739
Date of filing Nov 18, 2003
Date of publication of application Jun 9, 2005
Date of registration Jan 8, 2010
Inventor
  • (In Japanese)田村 俊樹
  • (In Japanese)小林 功
  • (In Japanese)全 国興
  • (In Japanese)神田 俊男
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title UTILIZATION OF DNA ENCODING KYNURENINE OXIDASE GENE OF SILKWORM
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for utilizing DNA encoding kynurenine oxidase gene of silkworm as a selection marker for a transgenic silkworm.
SOLUTION: A new vector plasmid to which a promoter of cytoplasmic actin of silkworm is linked is built on the upstream zone of kynurenine oxidase cDNA prepared from a wild silkworm in a vector derived from transposon piggyBac, and the vector plasmid is introduced into the egg of a white egg line silkworm obtained by making a silkworm of a first white egg mutation line (w-1) cross with a silkworm of a colored nondormant line (pnd). As a result, color of eyes of an adult moth or egg of a second-generation moth into which the vector is introduced is changed to blackish brown. The color of the skin of larva individual into which the gene is introduced is further changed to blackish brown and the change can be identified by naked eyes.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


遺伝子操作技術を利用して、組み換えタンパク質を生産する方法には、大腸菌や酵母、哺乳動物の培養細胞、植物や動物の個体を使う方法等が知られている。昆虫を使った組み換えタンパク質の生産系については、これまでに鱗翅目昆虫の核多核体病ウイルスによる方法とトランスジェニックカイコを用いる方法(非特許文献1~7)が開発されている。前者はベクターとしてDNA型のウイルスを用いている。そのため、比較的容易に組み換えウイルスを作出し、これをカイコなどの幼虫個体に感染させることができる。感染後、ウイルスは昆虫の個体内で増殖し、これに伴ってウイルス中に導入した遺伝子から組み換えタンパク質が合成される。この場合、ウイルス感染後の幼虫は数日後には死滅し、死ぬ直前のカイコ体液を採取してタンパク質を精製する。そのため、生産できるタンパク質量は多くの場合、体液1ml当たり1mg以下で、精製に多くの労力を要するという問題点がある。トランスジェニックカイコに関しては、近年、トランスポゾンやマーカー遺伝子を利用した新しいトランスジェニックカイコの作出方法が開発された(非特許文献1~7)。該方法は、DNA型のトランスポゾンpiggyBacをベクターとして用いており、マーカー遺伝子としては緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子が用いられている。この方法は効率良く組み換え体を作ることができることから、有用なタンパク質の生産や新しい繊維の生産、ウイルス抵抗性を付与した品種の作出など多くの実用的な面で利用することができ、その研究の一部については既に着手されている。



しかしながら、組み換え体をスクリーニングするためのマーカーとして用いるGFPを検出するには高価な蛍光実体顕微鏡を用いる必要があり、加えてこの遺伝子は他者により特許が取得されている。にもかかわらず、これまでのところ、特殊な装置が不要で、使用に制約の無いマーカー遺伝子は開発されていない。



なお、本発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
【非特許文献1】
田村俊樹(1999)トランスポソンを利用した形質転換カイコの作出方法.第7回昆虫機能研究会講演要旨、p10-22.
【非特許文献2】
Horn, C., B. Jaunich and E. A. Wimmer,(2000)Highly sensitive, fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis. Dev Genes Evol 210: 623-629.
【非特許文献3】
Horn, C., and E. A. Wimmer,(2000)A versatile vector set for animal transgenesis. Dev Genes Evol 210: 630-637.
【非特許文献4】
Thomas, J. L., M. Da Rocha, A. Besse, B. Mauchamp and G. Chavancy, 2002 3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L. from the embryonic stage onwards. Insect Biochem Mol Biol 32: 247-253.
【非特許文献5】
Tamura, T., Thibert, C., Royer ,C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P. (2000) A piggyBac element-derived vector efficiently promotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L. Nature Biotechnology 18, 81-84.
【非特許文献6】
Berghammer, A. J., M. Klingler and E. A. Wimmer,(1999) A universal marker for transgenic insects. Nature 402: 370-371.
【非特許文献7】
富田正浩、佐藤勉、安達敬泰、宗綱洋人、田村俊樹、神田俊男、吉里勝利(2001)ヒトコラーゲン遺伝子を組み込んだトランスジェニックカイコの作出.第24回日本分子生物学会年会講演要旨.
【非特許文献8】
田村俊樹(2000)トランスジェニックカイコ:現状と展望.日蚕雑69、1-12.
【非特許文献9】
田村俊樹(2000)カイコ発生における有用遺伝子導入.第21回基礎育種シンポジウム報告:動植物分子育種における発生工学的手法の展開。p23-29.
【非特許文献10】
Tamura, T., Quan, G.X., Kanda, T., and Kuwabara, N. (2001) Transgenic silkworm research in Japan: Recent progress and future. Proceeding of Joint International Symposium of Insect COE Research Program and Insect Factory Research Project. p77-82.
【非特許文献11】
Tomita M, M. H., Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K.,(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. Nat Biotechnol 21, 52-56.

Field of industrial application (In Japanese)


本発明はカイコのキヌレニン酸化酵素遺伝子をコードするDNAの利用に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下(a)~(d)のいずれかに記載のキヌレニン酸化酵素をコードするDNAを、キヌレニン酸化酵素をコードする遺伝子領域に変異が生じた、第一白卵突然変異系統のカイコの卵に導入する工程を含む、カイコの皮膚を変色させる方法であって、キヌレニン酸化酵素をコードするDNAが、カイコの細胞質アクチンプロモーター領域と機能的に結合している、前記方法
(a)配列番号:1に記載のDNA、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において30アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、カイコのキヌレニン酸化酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、カイコのキヌレニン酸化酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。

【請求項2】
 
キヌレニン酸化酵素をコードする遺伝子領域に変異が生じたカイコが、第一白卵突然変異系統のカイコおよび着色非休眠卵系統のカイコを交配することで得られる白卵系統のカイコである請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
1齢幼虫の皮膚が変色する、請求項1又は2記載の方法。

【請求項4】
 
以下(a)~(d)のいずれかに記載のキヌレニン酸化酵素をコードするDNAを有効成分として含有する、キヌレニン酸化酵素をコードする遺伝子領域に変異が生じた、第一白卵突然変異系統のカイコの皮膚を変色させるための薬剤であって、キヌレニン酸化酵素をコードするDNAが、カイコの細胞質アクチンプロモーター領域と機能的に結合している、前記薬剤
(a)配列番号:1に記載のDNA、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において30アミノ酸以内のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、カイコのキヌレニン酸化酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA、
(d)配列番号:2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、カイコのキヌレニン酸化酵素と機能的に同等なタンパク質をコードするDNA。

【請求項5】
 
キヌレニン酸化酵素をコードする遺伝子領域に変異が生じたカイコが、第一白卵突然変異系統のカイコおよび着色非休眠卵系統のカイコを交配することで得られる白卵系統のカイコである請求項4に記載の薬剤。

【請求項6】
 
1齢幼虫の皮膚が変色する、請求項4又は5記載の薬剤。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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25426_01SUM.gif
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