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METHOD FOR PRODUCING TRANSFORMANT FOR PRODUCING PROTEIN, THE RESULTANT TRANSFORMANT, AND USE OF THE SAME meetings

Patent code P05P002363
File No. A181P112
Posted date Sep 22, 2005
Application number P2004-056912
Publication number P2005-245228A
Patent number P4388392
Date of filing Mar 1, 2004
Date of publication of application Sep 15, 2005
Date of registration Oct 9, 2009
Inventor
  • (In Japanese)森 正之
  • (In Japanese)土肥 浩二
  • (In Japanese)石川 雅之
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title METHOD FOR PRODUCING TRANSFORMANT FOR PRODUCING PROTEIN, THE RESULTANT TRANSFORMANT, AND USE OF THE SAME meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a method for producing in high probability a transformant(cell) highly expressing the aimed protein through inducing and expressing a virus vector in high efficiency, thus realizing a method for producing the protein using a high-efficiency mRNA inducing amplification system.
SOLUTION: The method for producing the transformant for producing the protein comprises the 1st transformation step of transducing a DNA fragment-introducing vector pER8(-Stu) for expressing a transcription factor into a host cell(tobacco BY2 cell), the step of selecting a transformant expressing the transcription factor from among the transformants obtained by the 1st transformation step, and the 2nd transformation step of transducing a DNA fragment-introducing vector pBICER8-ToMVerG3(SF3) for expressing the aimed protein into the transformant selected by the selection step.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年、植物を食糧のみならず医薬品をはじめとする有用タンパク質の生産工場として利用することを目指し、開発が進められている。このような試みは、分子農業と呼ばれ次世代農業として期待されている。



現在植物における有用タンパク質の生産は、形質転換植物(植物細胞)を用いる方法(例えば非特許文献1参照)と、ウイルスベクターを植物に感染させる方法のいずれかで行われている(例えば非特許文献2参照)。前者は植物を栽培するだけで生産が可能であり、大規模化に適しているが、1細胞あたりの生産効率は著しく低い。一方、後者は前者に比べ高い生産効率を得ることができるが、接種作業およびウイルスの外界への飛散等が大規模化に際しての問題点となっている。



本発明者らは、上記両者の利点、すなわち大規模生産能力・高い生産効率および安全性を併せ持つ新しいタンパク質合成系(高効率mRNA誘導増幅系)を開発した。この高効率mRNA誘導増幅系の特徴は、ウイルスの複製酵素遺伝子と、それにより増幅される有用タンパク質遺伝子とを、共に植物の染色体に組み込むことであり、さらに、その組み換え植物での複製酵素の発現を制御することにより、有用タンパク質の合成を制御する点である(非特許文献3参照)。



さらに、本発明者らは、植物のサイレンシング反応に対するサプレッサーを持つウイルスを利用することにより、上記高効率mRNA誘導増幅系のmRNAの増幅効率を向上させることに成功した(非特許文献4および5参照)。



また本発明者らは、上記高効率mRNA誘導増幅系において、ウイルスcDNAの3’末端にリボザイム配列を組み込みんだ結果、リボザイム配列無しの場合に比べてウイルスRNA増殖が顕著に増加することを発見した(例えば非特許文献5)。
【非特許文献1】
Glynis Giddings, Gordon Allison, Douglas Brooks & Adrian Carter. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology 2000,18: 1151-1155.
【非特許文献2】
Pogue GP, Lindbo JA, Garger SJ, Fitzmaurice WP Making an ally from an enemy: Plant virology and the new agriculture. Annu Rev Phytopathol. 2002, 40: 45-74.
【非特許文献3】
Mori, M., Fujihara, N., Mise, K. and Furusawa, I. (2001) Inducible high-level mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plants. Plant J 27(1), 79-86.
【非特許文献4】
石川県農業短期大学附属農業資源研究所平成13年度年報 No.10 2001、p.14-15.(発行日:平成14年9月25日)
【非特許文献5】
石川県農業短期大学附属農業資源研究所平成14年度年報 No.11 2002、p.14-15.(発行日:平成15年12月26日)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、タンパク質生産に用いる形質転換体であって、任意のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたウイルスベクターを誘導発現する形質転換体を高確率に生産する方法、および当該生産方法によって生産されたタンパク質生産用形質転換体、並びにその利用の一例に関するものである。



より具体的には、転写因子発現用DNA断片を導入する第一形質転換工程と、前記工程によって得られた形質転換体の中から転写因子を発現する形質転換体を選抜する選抜工程と、タンパク質発現用DNA断片を前記選抜工程によって得られた形質転換体に導入する第二形質転換工程とからなるタンパク質生産用形質転換体の生産方法、および当該生産方法によって生産されたタンパク質生産用形質転換体、並びに上記タンパク質生産用形質転換体を用いたタンパク質の生産方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ホルモンによって活性化される性質を有する転写因子をコードする遺伝子と転写因子発現用プロモーターとが連結されてなる転写因子発現用DNA断片を植物由来培養細胞に導入する第一形質転換工程と、
前記第一形質転換工程によって得られた植物由来培養細胞の中から前記転写因子を発現する植物由来培養細胞を選抜する選抜工程と、
植物のサイレンシングを抑制する因子を持つ植物ウイルス由来の、RNAを遺伝子とするウイルスに任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのcDNAと、上記転写因子で転写誘導される転写誘導型プロモーターとが連結されてなるタンパク質発現用DNA断片を、前記選抜工程によって選抜された植物由来培養細胞に導入する第二形質転換工程とからなることを特徴とするタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項2】
 
上記転写因子がエストロジェンレセプターを含むことを特徴とする請求項1に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項3】
 
上記ホルモンが、エストロジェン、ステロイドホルモンまたはエクジソンであることを特徴とする請求項1または2に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項4】
 
上記エストロジェンで活性化される性質を有する転写因子としてLexA-VP16-hERを用い、上記転写誘導型プロモーターとしてOLexA-46を用いることを特徴とする請求項3に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項5】
 
上記ウイルスは、ポティ属ウイルス、ククモウイルス属ウイルス、ポテックスウイルス属ウイルス、トンブスウイルス属ウイルス、カルモウイルス属ウイルス、トバモウイルス属ウイルスからなる群より選択されるウイルスのいずれかであることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項6】
 
上記ウイルスベクターが、トバモウイルス属に属するウイルス由来であることを特徴とする請求項5に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項7】
 
上記ウイルスベクターが、トマトモザイクウイルスベクターまたはタバコモザイクウイルスベクターであることを特徴とする請求項6に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項8】
 
上記ウイルスベクターのcDNAの3’末端に、上記任意のタンパク質をコードする遺伝子を挿入したウイルスベクターのcDNAから転写されたウイルスRNAの3’末端に付加された余分な配列を切断するリボザイム配列が結合していることを特徴とする請求項1ないし7のいずれか1項に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項9】
 
上記余分な配列とは、ターミネーター由来の配列またはポリA配列であることを特徴とする請求項8に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項10】
 
上記リボザイム配列が、肝炎デルタウイルスのリボザイム配列、またはサテライトタバコリングスポットウイルスのリボザイム配列であることを特徴とする請求項8または9に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項11】
 
上記任意のタンパク質をコードする遺伝子が、上記ウイルスの外被タンパク質をコードする遺伝子と置換されていることを特徴とする請求項1ないし10のいずれか1項に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項12】
 
上記転写因子発現用DNA断片、および上記タンパク質発現用DNA断片が、アグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする請求項1ないし11のいずれか1項に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項13】
 
上記植物由来培養細胞がタバコ由来細胞であることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。

【請求項14】
 
上記タバコ由来細胞がタバコBY2細胞であることを特徴とする請求項13に記載のタンパク質生産用植物由来培養細胞の生産方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2004056912thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Plants Function and Their Control AREA
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