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METHOD FOR AMPLIFYING CIRCULAR DNA

Patent code P06A008362
File No. 動物バイオ-95
Posted date Apr 14, 2006
Application number P2004-045862
Publication number P2005-229950A
Patent number P4214230
Date of filing Feb 23, 2004
Date of publication of application Sep 2, 2005
Date of registration Nov 14, 2008
Inventor
  • (In Japanese)藤井 亮太
  • (In Japanese)北岡 本光
  • (In Japanese)林 清
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title METHOD FOR AMPLIFYING CIRCULAR DNA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for easily and quickly carry out the amplification of a circular DNA and the transfer of a random mutation to the circular DNA.
SOLUTION: The amplification method for the circular DNA contains (a) a step to amplify a DNA by a rolling circle type amplification method using a circular DNA as a template to obtain an amplification product composed of a straight-chain DNA and (b) a step to transform a procaryotic host cell by using the obtained amplification product to reconstruct the circular DNA in the cell. The method for transferring a random mutation to the circular DNA contains (c) a step to amplify a DNA by a rolling circle type amplification method using a circular DNA as a template under a condition to lower the fidelity of replication to obtain an amplification product composed of a straight-chain DNA and (d) a step to transform a host cell by using the obtained amplification product and reconstruct the circular DNA in the cell.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


外来性の遺伝子を挿入でき、宿主内で自立的に増殖できるDNAをベクターと呼ぶ。プラスミドなどのベクターは、分子生物学における基本的ツールとして、DNAの発現やクローニングなど、さまざまな用途で用いられている。これらのベクターは、対象とするDNAをインサートとして組み込んで環状化した後に、宿主細胞を形質転換するのに用いられる。ここで、インサートを組み込んだベクターの濃度が不十分だと、形質転換の際に十分な数の形質転換体が得られないことがある。その場合、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてインサートを増幅してから形質転換する手法が一般的である。すなわち、インサート部分をPCRで増幅し、増幅産物を制限酵素で切り出し、リガーゼを用いて新たなベクターに連結し、それから宿主細胞を形質転換することによって増幅した環状DNAを得る。ところが上記のような手法では、PCRを行うにあたり特異的なプライマーを設計し、なおかつ増幅時の温度条件を細かく設定しなければならず、またPCR産物を適当な制限酵素で切断してリガーゼでベクターに組み込む操作も必要なことから手間がかかる。特に、cDNAのように多様な遺伝子がベクターに挿入されている場合、すなわち遺伝子ライブラリーを形成している場合は、増幅から形質転換までの操作の条件検討に厳密さが求められ、高い効率で行わないと、形質転換の際にライブラリーの多様性を減少させてしまう可能性がある。もし、制限酵素やリガーゼを用いずに増幅から形質転換までの操作を簡略化することができれば、作業の効率化につながると考えられる。



一方、遺伝子工学の進歩のおかげで、タンパク質を遺伝子レベルで操作し、機能を改変することができるようになった。たとえば、酵素にランダム変異を導入し、機能の変化した変異体を選抜することで、酵素の機能を改変することも可能である。特に、ランダム変異と選抜の操作を繰り返して酵素の機能を徐々に向上させる技術は進化分子工学と呼ばれ、理論上は酵素の性質を思い通りに改変することができることから、汎用性が高く、研究や産業の分野で幅広く利用されている。遺伝子にランダム変異を導入する手法は数多く知られている。ランダム変異導入方法の多くは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるDNA増幅反応を利用している。よく利用されるランダム変異導入方法としては、反応溶液にマンガンイオンを加えるなどして、ポリメラーゼ複製の忠実度(相補鎖に対して正しい塩基対を形成するように塩基を導入する率)を低下させることで、ランダム変異を導入しつつDNAを増幅する手法(エラープローン PCR)がある(非特許文献1)。エラープローン PCRは特殊な技術や試薬を使用していないため、現時点では最も簡便で変異のバリエーションの多いランダム変異導入方法であるといえる。ほかにも、核酸類縁体をPCR増幅時に取り込ませることでDNA複製の忠実度を低下させる方法や、dNTPを織り交ぜた核酸配列を合成することで変異を導入する方法もある。このように、ランダム変異導入方法の多くが、PCRによるDNA増幅に依存している。しかしながら、PCRを利用した変異導入方法では、通常、増幅産物をベクターに挿入する操作が必要である。具体的には、(i)PCR増幅産物の末端を適当な制限酵素で切断する、(ii)アガロースゲル電気泳動法などにより増幅産物を分画して精製する、(iii)リガーゼを使って、増幅産物を適当なベクターの制限酵素サイトに連結する、という操作である。ところが、各操作での収率や純度が高くないと、変異体ライブラリーのバリエーションが低下する恐れがあるため、各操作の条件検討は慎重に行う必要があり、相応の手間と時間を要する。



このように、PCRによる遺伝子増幅法は、遺伝子工学分野において汎用されているが、近年、PCR以外の新規遺伝子増幅法がいくつか開発され、高い注目を集めている。たとえば、自然界におけるλファージなどの複製機構であるローリングサークル型複製機構(Kornberg, A. and Baker, T.A. 1992. DNA replication. W.H. Freeman and Company, San Francisco)を利用して環状DNAを指数関数的に増幅する手法が知られており、ローリングサークル型増幅(RCA)法と呼ばれている(特許文献1、非特許文献2等参照)。RCA法により得られる増幅産物は、環状DNAの一周分のDNA配列が反復した直鎖状DNAであり、例えば微量な環状DNAからサイクルシークエンス反応のための鋳型DNAを調製することなどにもっぱら利用されていた(非特許文献3等参照)。また、酵母のコロニー由来のプラスミドDNAをRCA法により増幅させたDNA産物を酵母に導入して環化された例は知られているが(非特許文献4)、大腸菌などの原核宿主細胞への形質転換については検討されておらず、また、RCA法を変異導入に利用した例はない。
【特許文献1】
USP 5854033号公報
【非特許文献1】
Leung et al. (1989). "A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction." Techniques 1(1): 11-15
【非特許文献2】
Dean et al. (2001). "Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification." Genome Res 11(6): 1095-1099
【非特許文献3】
Nelson et al. (2002). "TempliPhi, phi29 DNA polymerase based rolling circle amplification of templates for DNA sequencing." Biotechniques Suppl: 44-47
【非特許文献4】
Ding et al. (2003). "Direct retransformation of yeast with plasmid DNA isolated from single yeast colonies using rolling circle amplification." Biotechniques 35(4): 774-779

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ローリングサークル型増幅(Rolling Circle Amplification:RCA)法を利用する環状DNAの増幅方法、及び環状DNAへのランダム変異導入方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の工程を含むことを特徴とする、環状DNAへのランダム変異導入方法。
(c)環状DNAを鋳型とし、複製の忠実度を低下させる条件下でローリングサークル型増幅法によりDNAを増幅し、直鎖状DNAからなる増幅産物を得る工程
(d)得られた増幅産物を用いて宿主細胞を形質転換し、該細胞内で環状DNAを再構築させる工程

【請求項2】
 
複製の忠実度の低下をマンガンイオンの添加により行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
 
環状DNAが宿主細胞内で独自に複製可能なDNAである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
宿主細胞内で独自に複製可能なDNAがプラスミドである、請求項4に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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23100_01SUM.gif
State of application right Registered


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