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DETERMINATION METHOD OF ACTIVE OXYGEN commons meetings

Patent code P06A008808
File No. ShIP-P04034
Posted date Jun 2, 2006
Application number P2004-309573
Publication number P2006-119085A
Patent number P4247393
Date of filing Oct 25, 2004
Date of publication of application May 11, 2006
Date of registration Jan 23, 2009
Inventor
  • (In Japanese)平川 和貴
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人静岡大学
Title DETERMINATION METHOD OF ACTIVE OXYGEN commons meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for determining active oxygen easily without using an expensive reagent, concerning a method for determining active oxygen by generating a fluorescent material from specific vitamin B or its derivative by a reaction with the active oxygen (for example, hydrogen peroxide).
SOLUTION: In this determination method of active oxygen, vitamin B or its derivative having a general formula 1 [R1 shows -OH, -OR, -R, -H, -NHR or -NH2, R2 shows -NH2, -OR, -R, -H or -NHR, R3 shows -H, -COR, -COCX3 or -R, R4 shows -COOH, -CONHR, -COR, -COOR, -CONHCH(COOH)(CH2COOH), -CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH) or -CONHCH(COOH)(CH2CH2PO(OH)CH(COOH)(CH2CH2COOH)), R denotes a hydrocarbon group having the carbon number of 1-8, and X denotes a halogen] is decomposed in the presence of metal ions and an active oxygen generation material, and thereby pteridines having a general formula 2 (R1 and R2 denote the same meaning described above, R5 denote -COOH, -CHO or -CH2OH), and the fluorescence intensity of the pteridines is measured.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


活性酸素は、発がん性物質の酸化還元反応、光触媒反応、光増感反応、細胞内の酸化系や還元系の還元又は励起によって生成し、細胞毒性の原因となる。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。また、活性酸素は蛋白質、低分子細胞成分、低分子化合物の自動酸化によっても生成することが知られている。



例えば、酸化チタンの光触媒作用で酸化された糖の酸化物と生体内金属イオンとの反応で活性酸素の一種である過酸化水素が生成し、DNA損傷が引き起こされることが非特許文献1に報告されている。



細胞毒性に関する場合、低い濃度の活性酸素でも大きな影響を示すことがある。この他、SUS管、銅管内で活性酸素が生成すると腐食を生じ、種々の水処理上のトラブルを生じることとなる。一方、活性酸素は利用の仕方如何では殺菌剤、殺藻剤、除草剤として用いることもできる。従って、活性酸素を高い感度で容易に定量することは各種産業分野において極めて重要なことである。



従来、活性酸素の検出方法としては次のような方法が提案されている。
酸化還元色素であるNBT(Nitro Blue Tetrazolium)と活性酸素の反応により生じるホルマザンを銅電極と照合電極とを浸漬し、両電極間の電位差を測定して活性酸素を定量する方法が特許文献1に開示されている。しかし、100ml程度の多量の試料が必要である。また、原理上、電極の使用が不可能な試料への適用が不可能である。



活性酸素によって酸化されると強い蛍光を有するフルオレセインやローダミンが生成することにより、蛍光強度の測定から活性酸素を検出する方法が、特許文献2に提案されている。しかし、これらの化合物は高価である。



一方、分解反応により蛍光強度が増強する化合物として、ビタミンBの一種である葉酸が報告されている。葉酸は、プテリジン環をもち、プテリジン化合物は、強い蛍光をもつものが多いが、葉酸からの蛍光はほとんど観測されない。それは、葉酸の分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためである。葉酸は、紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有するプテリン-6-カルボン酸が生成することが、非特許文献2に報告されている。



即ち、非特許文献2には、式(3′):
【化9】



で示される、ビタミンBの一種である葉酸に紫外線を作用させると、その葉酸が加水分解されて、化学式(1′):
【化10】



で示される、可視光の蛍光を発するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物(プテリン-6-カルボン酸)が光化学反応でDNA損傷を引き起こすことが報告されている。



しかし、前記の葉酸が紫外線以外の手段によって分解されて、蛍光を有するプテリジン類を生成することについては、非特許文献2を含めこれまでまったく記載されていない。



また、葉酸の誘導体であるアメトプテリンが紫外線の照射で分解し、強い蛍光を有する2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシメチルプテリジンを生成することが、非特許文献3に報告されている。



このアメトプテリンもプテリジン環をもつが、アメトプテリンからの蛍光はほとんど観測されない。葉酸と同様にアメトプテリンの分子内のアミノベンゾイル残基により励起状態が失活するためであるが、その分解により2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシメチルプテリジンが生成すると強い蛍光を示すようになる。この非特許文献3には、アメトプテリンの紫外線による分解で生成した2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシメチルプテリジンが光化学反応でDNA損傷を引き起こすことが報告されている。



即ち、非特許文献3には、化学式(4):
【化11】



で示されるビタミンBの一種である葉酸の誘導体であるメトトレキサート(アメトプテリンの別名、Methotrexateともいう。)に紫外線を作用させると、化学式2:
【化12】



で示される、可視光の蛍光を有するプテリジン化合物が生成し、このプテリジン化合物が光化学反応でDNA損傷を引き起こすことが開示されている。



しかし、葉酸の誘導体であるこのアメトプテリンが紫外線の照射以外で分解され、強い蛍光を有する2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシメチルプテリジンを生成することはこれまで知られていない。



一方、金属イオンの存在下で、過酸化水素が生成することは、発がん性物質セミカルバジドと銅(II)イオンとの反応で過酸化水素が生成し、DNA損傷が引き起こされること(非特許文献4)、酸化チタン光触媒により酸化された糖と銅(II)イオンとの反応で過酸化水素を生成し、DNA損傷が引き起されること(非特許文献1)、銅(II)イオンの触媒作用によるベンゼンジオールの自動酸化反応により過酸化水素が生成し、DNA損傷を引き起こすことが報告されている(非特許文献5)。しかし、このような過酸化水素で葉酸やアメトプテリンが分解され強い蛍光を有するプテリジン化合物が生成することや、さらにこの蛍光物質を分解に関与した過酸化水素の定量に利用できることは知られていなかった。



【特許文献1】
特開平07-301618号
【特許文献2】
特開2000-321262号
【非特許文献1】
光化学討論会 講演要旨集 2003年11月22日(土)~24日(月) 3D06
【非特許文献2】
K. Hirakawa et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 410巻, 261-268頁, 2003年.
【非特許文献3】
K. Hirakawa et al. Photochemistry and Photobiology, 76巻, 467-472頁, 2002年.
【非特許文献4】
K. Hirakawa, et al. Mutation Research 536巻, 91-101頁, 2003年.
【非特許文献5】
K. Hirakawa et al. Chemical Research in Toxicology 15巻, 76-82頁, 2002年.

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、特定のビタミンB又はその誘導体を活性酸素(例えば過酸化水素)との反応により蛍光性物質を生成させて活性酸素を定量する方法に係わる。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
一般式1:
【化1】
 



〔但し、式中、R1-OH又は-NH2、R2-NH2、R3-H又は-CH3、R4-CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH)を示す。なお、R1の-OHは、=Oであってもよい〕で示されるビタミンB又はその誘導体と、銅(II)イオン、鉄(II)イオン、金(III)イオン及び/若しくは白金(IV)イオン、および活性酸素生成物質を含有する試料の存在下で、活性酸素により、当該ビタミンB又はその誘導体を酸化分解して、
一般式2:
【化2】
 



(但し、式中、R1及びR2は前記と同じ意味を示し、R5-COOH又は-CH2OHを示す。)で示される可視光の蛍光を有するプテリジン類を生成させ、当該プテリジン類の蛍光強度を測定することによって活性酸素を定量することを特徴とする活性酸素の定量法。

【請求項2】
 
ビタミンB又はその誘導体が、一般式3:
【化3】
 



〔但し、式中、R2-NH2、R3-H、R4-CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH)を示す。なお、一般式1のR1に対応する一般式3の-OHは、=Oであってもよい〕であって、プテリジン類に係わる一般式2におけるR1が-OH(但し、-OHは、=Oであってもよい)で示されるものである、請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項3】
 
ビタミンB又はその誘導体が、一般式4:
【化4】
 



〔但し、式中、R2-NH2、R3は-CH3、R4-CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH)を示す。〕であって、プテリジン類に係わる一般式2におけるR1が-NH2で示されるものである請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項4】
 
金属イオンが二価の銅イオンである請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項5】
 
活性酸素が過酸化水素である請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項6】
 
ビタミンB又はその誘導体が、一般式5:
【化5】
 



〔但し、式中、R3-H、R4-CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH)を示す。なお、一般式1のR1に対応する一般式5の-OHは、=Oであってもよい〕であると共に、プテリジン類が、化学式1:
【化6】
 



但し、式中、一般式2のR1に対応する化学式1の-OHは、=Oであってもよい〕で示される化合物である請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項7】
 
ビタミンB又はその誘導体が、一般式6:
【化7】
 



〔但し、式中、R3CH3、R4-CONHCH(COOH)(CH2CH2COOH)を示す。〕であると共に、プテリジン類が、化学式2:
【化8】
 



である、請求項1に記載の活性酸素の定量法。

【請求項8】
 
請求項1~7のいずれか一項記載の活性酸素定量法から、活性酸素生成物質の量を測定する、活性酸素生成物質定量法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2004309573thum.jpg
State of application right Registered
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