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PRODUCTIVITY CONTROLLING FACTOR OF ALKALOID meetings

Patent code P06P003870
File No. 652
Posted date Jun 23, 2006
Application number P2004-348513
Publication number P2006-149333A
Patent number P4465468
Date of filing Dec 1, 2004
Date of publication of application Jun 15, 2006
Date of registration Mar 5, 2010
Inventor
  • (In Japanese)佐藤 文彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人京都大学
Title PRODUCTIVITY CONTROLLING FACTOR OF ALKALOID meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a gene encoding a transcription factor comprehensively controlling a plurality of gene expressions of an alkaloid biosynthesis pathway.
SOLUTION: The gene comprises a polynucleotide of a specific base sequence isolated from a cultured cell of Coptis japonica having high alkaloid biosynthesis ability.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


長い進化の過程で植物は特異的で高度な二次代謝系を獲得してきた。二次代謝産物の種類は数万から数百万ともいわれ、一般的にアルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、フェニルプロパノイドに分類される。これら二次代謝産物の機能は主に外敵からの防御と考えられているが未だ得られている情報は非常に少ない。



植物が生産する様々な二次代謝産物は香料、色素、医薬品などとして多用されているが、その生産効率ならびに品質の均質性に問題があり、化学合成への転換が行われてきた。しかし、化学合成にともなう様々な問題ならびに天然物指向の高まりとともに、植物が本来持つ生産性をもとにした物質生産系の開発が求められている。



特に、多様な二次代謝産物のなかでも生理活性を有するアルカロイド種は、現在においても市販されている医薬品の成分として非常に高い需要があり、大量に供給する方法が検討されている。一般にアルカロイド種は含窒素複素環をもつ天然高分子で化学構造が複雑なために化学的合成は困難であり、植物体からの抽出が主たる生産法である。ところが植物から採取できる量は少なく、人為的改良を施した植物体による高生産システムの確立が要望されている。そこで、遺伝子工学的手法を導入することにより生合成効率の上昇、人工的な経路による新生成物の産出などを目的とした代謝工学という新たな分野が試みられている(非特許文献1、2参照)。



植物の多くの代謝経路は転写制御を受け、代謝経路に関連する遺伝子の転写は発生、環境またはホルモンプロセスなどにより制御される。従来からの植物代謝経路を人為的に操作して有用物質を蓄積させる方法は、代謝経路の律速段階である工程を制御することによるものであった。しかし律速段階の同定は困難であることが多く、最終生成物の蓄積は複数の酵素活性によって制限されることが多いため、かかる方法はあまり成功していない。



そのため、複数の代謝工程を制御しうる転写因子を操作する方法が提案されるが、転写制御は複雑なメカニズムであり、所望の代謝産物を得ることは困難であった。すなわち、転写制御を行うためには、標的配列に結合するか、あるいは転写を活性化する複数のタンパク質が必要であることが多い。さらに、転写因子を過剰発現させることにより代謝経路を活性化しようとしても、植物の成長・発達が阻害されることがあった。



複数の代謝経路の工程を制御することによって所望の代謝産物を得る試みは有望であるが、植物の二次代謝経路は複雑であることからいままでアルカロイド生合成系を包括的に制御しうる転写因子は同定されていない。



アルカロイドのなかでも、イソキノリン誘導体及び生合成的にこれに由来するイソキノリン系アルカロイドには、ベルベリン、モルフィン、パパベリンなど強い生理活性を有するものが多く、多くの医薬品に使用されている。このイソキノリンアルカロイドの生合成系の前半部分は各化合物で共通しているため、イソキノリンアルカロイドの生合成系の遺伝子ならびに制御遺伝子の単離、同定が不可欠である。



本発明者は、アルカロイド高生産性オウレン細胞から、アルカロイド生合成酵素遺伝子ならびにその制御遺伝子を包括的に単離する方法を提案し、実際にベルベリン生合成系に関与すると期待できる多くの新規遺伝子・制御候補遺伝子を単離している(特許文献1)。



具体的には、薬用植物として知られるオウレンのベルベリン生合成系の研究を進めた結果、現在までに多くのベルベリン生合成関連遺伝子を単離、同定することにより生合成経路の全貌を明らかにしつつある。



即ち、ベンジルイソキノリンアルカロイドであるベルベリンは、図1に示すようにアミノ酸であるチロシン2分子から13段階の酵素反応によって生合成される。本発明者はこれまでにベルベリン生産性の高い培養細胞を材料として生合成酵素を精製し、それぞれの酵素に対応する遺伝子を単離、同定してきた。



これまで、インドールアルカロイドを生産するニチニチソウにおいてアルカロイド生合成系遺伝子の転写因子ORCAが報告されているが、同遺伝子による発現制御は部分的であり、包括的な生合成制御遺伝子ではない。イソキノリンアルカロイド生合成系においても、複数の工程を包括的に制御する転写因子は今まで知られていない。
【特許文献1】
特開2004-121233号公報
【非特許文献1】
Current Opinion in Plant Biology 2004 7;202-209
【非特許文献2】
Current Opinion in Biotechnology 2002 13;181-187

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、植物の二次代謝産物の一つであり、医薬品として利用度の高いイソキノリンアルカロイドの生合成を制御する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子、および該遺伝子によってコードされる転写因子、ならびに該遺伝子を用いるイソキノリンアルカロイドの生産方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号1で表される塩基配列の第86~772塩基からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項2】
 
配列番号1で表される塩基配列の第86~772塩基からなるポリヌクレオチドにおいて1もしくは数個の塩基または塩基対が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項3】
 
配列番号1で表される塩基配列の第86~772塩基からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項4】
 
配列番号1で表される塩基配列の第86~772塩基からなるポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで90%以上の相同性を示し、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項5】
 
以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。

【請求項6】
 
イソキノリンアルカロイド産生植物由来である請求項1から5のいずれかの遺伝子。

【請求項7】
 
オウレン由来である請求項6の遺伝子。

【請求項8】
 
以下の(c)または(d)のタンパク質:
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。

【請求項9】
 
以下の(e)または(f)のタンパク質:
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とアミノ酸レベルで90%以上の相同性を示し、かつ、イソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子として作用するタンパク質。

【請求項10】
 
請求項1から7のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質。

【請求項11】
 
請求項1から7のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。

【請求項12】
 
請求項11の組換えベクターを含む形質転換植物細胞。

【請求項13】
 
イソキノリンアルカロイド産生植物細胞である請求項12の形質転換植物細胞。

【請求項14】
 
オウレン細胞である請求項13の形質転換植物細胞。

【請求項15】
 
請求項12から14のいずれかの形質転換植物細胞を培養し、細胞内でイソキノリンアルカロイド生合成系遺伝子発現を誘導する転写因子を過剰発現させる工程、および、得られる培養物からイソキノリンアルカロイドを採取する工程を含む、イソキノリンアルカロイドの生産方法。

【請求項16】
 
イソキノリンアルカロイドがベルベリンである請求項15の方法。

【請求項17】
 
請求項12から14のいずれかの形質転換植物細胞を含む形質転換植物。

【請求項18】
 
形質転換植物が植物体、植物器官、植物組織または植物培養細胞である請求項17の形質転換植物。

【請求項19】
 
請求項1から7のいずれかの遺伝子の発現を阻害する工程を含む、植物においてイソキノリンアルカロイド生合成を阻害する方法。

【請求項20】
 
発現の阻害をRNAi法により行う請求項19の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2004348513thum.jpg
State of application right Registered
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