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METHOD FOR OBTAINING CONJUGATED PROTEIN HAVING LIGAND AFFINITY, METHOD FOR ANTIBODY SCREENING, KIT FOR ANTIBODY SCREENING, METHOD OF MEDICINAL TREATMENT, ANTIBODY MEDICINE, IMMUNOLOGICALLY NONREACTIVE ANTIBODY MEDICINE AND METHOD OF ADMINISTRATION commons

Patent code P06P003552
File No. NU-0023
Posted date Feb 23, 2007
Application number P2004-349309
Publication number P2006-158203A
Patent number P4686682
Date of filing Dec 2, 2004
Date of publication of application Jun 22, 2006
Date of registration Feb 25, 2011
Inventor
  • (In Japanese)中野 秀雄
  • (In Japanese)ジャン シュウ ピン
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人名古屋大学
Title METHOD FOR OBTAINING CONJUGATED PROTEIN HAVING LIGAND AFFINITY, METHOD FOR ANTIBODY SCREENING, KIT FOR ANTIBODY SCREENING, METHOD OF MEDICINAL TREATMENT, ANTIBODY MEDICINE, IMMUNOLOGICALLY NONREACTIVE ANTIBODY MEDICINE AND METHOD OF ADMINISTRATION commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technology for obtaining one kind or more of proteins specified from among extremely multiple kinds of proteins having ligand affinity quickly, in a large amount and in a high purity.
SOLUTION: This method for obtaining conjugated proteins having the ligand affinity is provided by (1) strictly separating antibody-producing cells including each exclusive producing means Xm for multiple kinds of conjugated proteins Xp by single cell isolation from a specimen of a human or non-human animal, (2) once converting the production means Xm to copying means Xc by a reverse transcription PCR method, (3) copying the copying means Xc by the PCR method in a large amount, (4) under adding transcription sequence, (5) producing the conjugated proteins Xp for each kind in a large amount by putting them in an in vitro transcription/translation-conjugating system and (6) performing the characterization of the conjugated proteins Xp as necessary.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


任意のリガンドに対して選択的な親和性を示すタンパク質は、一般的な技術分野においては、当該リガンドの検出手段、分離手段あるいは精製手段として重要である。



一方、医学あるいは生理学の分野においては、このような親和性タンパク質として、ヒト又は少なくとも免疫反応による抗体の産生が認められる非ヒト動物において生成される極めて多種類の抗体を代表的に例示することができる。抗体は免疫学における重要な生体分子であり、ヒト又は非ヒト動物の疾患の予防、診断あるいは治療等に広範囲に応用することができる。非ヒト動物を用いた病理研究等にも広範囲に応用することができる。抗体の内でも、特に、いわゆるハイブリドーマ技術によって大量生産が可能となったMabは極めて重要である。



一般的に、リガンド親和性タンパク質を取得する場合において、例えば任意の抗原即ちリガンドで免疫した非ヒト動物、ヒトにおける各種の感染症患者、あるいは、ガン細胞がリガンドとなって抗体を生成しているガン患者等に典型的に見られるように、リガンドに対する親和性又は結合力等に差異のある極めて多種類の類似タンパク質が存在する場合が多い。



例えばポリクローナル抗体を使用する場合のように、このような類似タンパク質群を混ぜ物としてそのまま利用することも、場合によって可能ではある。しかし、リガンドの検出手段、分離手段あるいは精製手段としても、疾患の予防、診断あるいは治療等の手段としても、多種類の類似タンパク質群の内から特定された1種類ごとの優れたリガンド親和性タンパク質のみを選択的に大量取得することが、圧倒的に有利である。



ハイブリドーマ技術は、1種類のリガンド親和性タンパク質のみを、Mabとして選択的に大量取得する可能性を切り開いた点で重要な意味を持つ。しかし、この技術では、動物の免疫反応を利用して抗原親和性タンパク質たる各種Mabの生産源である多数のB細胞を調製する点は良いとしても、その後、例えば安定したハイブリドーマの作成(タンパク質の生産手段の調製)に困難があったり、ハイブリドーマの培養と増殖(タンパク質の生産手段の大規模化)に非常に手間がかかる等の問題がある。従って、実用技術としては、迅速な大量生産及び高速多検体スクリーニングと言う要求に十分に応えることができない。



近年、ハイブリドーマ技術の上記問題点に鑑み、B細胞の生成と組織培養を不要化するため、例えば、キメラモノクローナル抗体(Vaquelo et al., 1999)、遺伝子導入マウス(Green et al., 1994)、ファージディスプレー(MacCafferty
et al., 1990)、リボソームディスプレー(Hanes & Plucthun, 1997)のような種々の遺伝子工学的技術の開発が図られている。しかしこれらの技術は、いわば要素技術に過ぎず、多様なリガンド親和性タンパク質を大量生産し高速多検体スクリーニングを行うと言う要求に全体的に応えることはできないし、より具体的なレベルの問題として、抗体のH鎖とL鎖とのオリジナルで正確なペアリングは得られていない。



【非特許文献1】
Coronella, J.A., Telleman, P., Truong, T.D., Ylera, F., Junghans, R.P., 2000. "Amplification of IgG VH and VL(Fab) fromsingle cell human plasma cells and B cells" Nucleic Acids Res. 28,e85 又、B細胞を迅速・正確に単離する技術、キット化された実験試薬、シークエンシングとその解析の自動化、単細胞逆転写PCR技術等が進歩し、例えば上記の非特許文献1で記載されているように、種々の細胞由来の抗体遺伝子の増幅が報告されて来た。即ち、単細胞逆転写PCRの利点により、単一の細胞から得た抗体のL鎖遺伝子とH鎖遺伝子とをそれぞれ増幅し、組換え大腸菌を用いた発現システムを利用すれば、抗体のH鎖とL鎖とのペアリングは実現できる。



しかし、逆転写PCR産物たる抗体遺伝子を、発現のためにベクターにクローニングする必要があり、そのクローニングと微生物での発現には非常に面倒な作業と長時間を要する。又、細胞毒性を有する抗体を扱うことが困難であるとか、極めて多数のクローン(極めて多数の組換え大腸菌)を扱うことが困難であるとかの問題がある。



以上の点は、特定されたリガンド親和性タンパク質に対する迅速な大量生産と高速多検体スクリーニングと言う一般的な技術手段としての要求に関する問題の指摘であるが、この問題を医学又は生理学の立場から見ると、優れた抗体スクリーニング方法、医療方法、抗体医薬等の提供の問題に直結するものである。更に、ヒトを対象とする場合には、免疫反応が関連する疾患等において、拒絶反応を伴わない非経口的投与を可能とする非免疫反応性抗体医薬の提供の問題にも直結するものである。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、リガンド親和性複合タンパク質の取得方法、抗体スクリーニング方法、抗体スクリーニング用キット、医療方法、抗体医薬、非免疫反応性抗体医薬、及び投薬方法に関する。



更に詳しくは、本発明は、特定されたリガンドに対して選択的な親和性を示す極めて多種類の複合タンパク質Xpの中から選ばれる1種又は2種以上の複合タンパク質を迅速かつ大量に取得することを可能とした、リガンド親和性複合タンパク質の取得方法に関する。このリガンド親和性複合タンパク質の取得方法は、ヒトに対して適用することができ、更に、少なくとも免疫反応による抗体の生成が認められる非ヒト動物に対しても適用することができる。



又、本発明は、上記のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法に基づいた、ハイ・スループット(High-throughput )なスクリーニングを迅速に実行可能とする抗体スクリーニング方法と、この抗体スクリーニング方法を行うための抗体スクリーニング用キットに関する。



又、本発明は、上記の抗体スクリーニング方法によって得られた抗体を用いる、ヒト又は上記の非ヒト動物に対する医療方法と、当該抗体を有効成分とする抗体医薬とに関する。



更に、本発明は、ヒトを適用対象とする上記のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法によって得られた抗体を有効成分とする医薬であって、適用対象たる当該ヒト個体に投与することを目的とする非免疫反応性抗体医薬と、この非免疫反応性抗体医薬を用いる投薬方法とに関する。



なお、本発明において、「リガンド」とは、任意の無機化合物や有機化合物、及び抗原たり得る各種の無機化合物や有機化合物、タンパク質、ウイルス、微生物等を制限なく含む概念である。リガンドが抗原である場合において、本発明のリガンド親和性複合タンパク質は抗体あるいはモノクローナル抗体(以下、単に「Mab」とも言う)であり得る。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
任意に特定された抗原たるリガンドXに対して抗原抗体反応を示す極めて多種類の免疫グロブリン(抗体)たる複合タンパク質Xpの中から、無作為にあるいは特性評価を通じて選ばれる1種又は2種以上の複合タンパク質を取得する方法であって、少なくとも下記の1)生産手段分離工程、2)生産手段転換工程、3)大量生産準備工程、4)転写用配列付加工程及び5)単一種大量生産工程を含み、必要に応じて更に下記の6)キャラクタリゼーション工程を含むことを特徴とするリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。
1)極めて多種類にわたる前記複合タンパク質Xpのそれぞれ専用の生産手段(mRNA)であって、容易に大量複製できる複製手段Xc(cDNA)への転換が可能な生産手段Xmを備えた抗体産生細胞の1個又は複数個の単細胞を、ヒト又は非ヒト動物たる検体の適宜な組織又は生体構成部分から個別に分離することにより、目的タンパク質の種類ごとに生産手段Xmを厳密に分離して、以下の各工程における生産手段Xm、複製手段Xc及び複合タンパク質Xpの異種間混在を予め防止する生産手段分離工程。
2)互いに分離された1種又は複数種の前記生産手段Xmについて、それぞれの生産手段Xmを構成するmRNAの全部又は一部を逆転写PCR法により複製手段Xcへ転換させる生産手段転換工程。
3)逆転写PCR法により得られた前記複製手段Xcを次の2段階PCRによって大量複製してタンパク質の大量生産能力を準備する大量生産準備工程。
第1段階PCR:複製手段Xcを構成する全ての種類のcDNAに対応する各種類のプライマーにおいて、それらの5’末端側に同一の付加配列を設けておいて増幅を行う。
第2段階PCR:第1段階PCRで増幅された全ての種類のDNAフラグメントに対して、前記付加配列に対して相補的な配列部分を備えた単一種類のプライマーを用いて増幅を行う。
4)大量複製された前記複製手段Xc(cDNA)に対して、その無細胞系での生産手段Xm(mRNA)への再転換に必要な転写用配列を付加する転写用配列付加工程。
5)転写用配列を付加された前記複製手段Xcを、少なくとも複製手段Xcの生産手段Xmへの再転換を行う要素と、生産手段Xmに基づきタンパク質の生産を行う要素とを備えた無細胞系へ投入することにより、前記複合タンパク質Xpを、又は前記生産手段転換工程で規定した一部のmRNAに対応する複合タンパク質Xpを、1種類ごとに大量生産する単一種大量生産工程。
6)以上の各工程により生産された複合タンパク質Xpについて、特性評価を行い、優れた特性を持つ複合タンパク質Xpをスクリーニングし、あるいはこれらの複合タンパク質Xpの配列決定を行うキャラクタリゼーション工程。

【請求項2】
 
前記検体がヒトである場合において、抗原たるリガンドXに対する抗体を既に体内に生成している生理状態にあると推定される被検者を選択したもとで、当該被検者から社会通念上許容される非侵襲的手段によって採取した適宜な組織又は生体構成部分について、前記1)の1個又は複数個の単細胞を分離することを特徴とする請求項1に記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項3】
 
前記被検者から、前記組織又は生体構成部分として採取した末梢血について、抗体産生細胞たるB細胞及び/又は形質細胞の単細胞を分離することを特徴とする請求項2に記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項4】
 
前記検体が非ヒト動物である場合において、この動物をリガンドXで免疫したもとで、当該動物の適宜な組織又は生体構成部分から前記1)の1個又は複数個の単細胞を分離することを特徴とする請求項1に記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項5】
 
前記生産手段分離工程において、前記検体の組織又は生体構成部分を液体中に投入して抗体産生細胞を分散・懸濁させ、一定の分離用抗体と結合させた磁性微粒子と共にインキュベートした後、分離用抗体を介して抗体産生細胞に結合した磁性微粒子をマグネットで回収することにより、前記懸濁液から目的とする抗体産生細胞の単細胞を分離することを特徴とする請求項1~請求項4のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項6】
 
前記生産手段転換工程において、逆転写PCRに用いるプライマーの設計により、特定の分類カテゴリーに属する複合タンパク質XpをコードするmRNAのみを複製手段Xcへ転換させ、及び/又は複合タンパク質Xpを構成する特定のフラグメントをコードするmRNAのみを前記複製手段Xcへ転換させることを特徴とする請求項1~請求項5のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項7】
 
前記第1段階PCRで用いる各種類のプライマーの付加配列中に、前記5)の無細胞系の由来生物を考慮した適宜な種類の翻訳開始促進配列部分を含めておくことを特徴とする請求項1~請求項6のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項8】
 
前記転写用配列付加工程において、大量生産準備工程で増幅されたDNAフラグメントに対して、少なくともプロモーター配列を付加するPCRを行うことを特徴とする請求項1~請求項7のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項9】
 
前記単一種大量生産工程において、前記無細胞系を還元化しないままの条件で用いることを特徴とする請求項1~請求項8のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項10】
 
前記キャラクタリゼーション工程が、複合タンパク質XpのELISA法によるリガンド親和性評価と、複合タンパク質Xp又はその遺伝子の配列決定と、形質転換体を用いて生産させた複合タンパク質XpのKd値の測定との内の少なくとも1項目を含むことを特徴とする請求項1~請求項9のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法。

【請求項11】
 
請求項1~請求項10のいずれかに記載のリガンド親和性複合タンパク質の取得方法を、ヒト又は非ヒト動物におけるリガンドXに対する抗体のスクリーニングに用いることを特徴とする抗体スクリーニング方法。

【請求項12】
 
請求項11に記載の抗体スクリーニング方法を実施するために用いられるキットであって、少なくとも以下の構成要素を含んで構成されることを特徴とする抗体スクリーニング用キット。
11)請求項5に規定する分散・懸濁用の液体と、磁性微粒子とのセット。
12)請求項6に規定する逆転写PCR用のプライマーセット。
13)請求項1に規定する2段階のPCR用のプライマーセット。
14)請求項1の5)に規定する無細胞系。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2004349309thum.jpg
State of application right Registered
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