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METHOD OF PRODUCING MYOCARDIAL GRAFT AND MYOCARDIAL DIFFERENTIATION ACCELERATOR

Patent code P07A010362
Posted date Aug 31, 2007
Application number P2005-033368
Publication number P2006-218035A
Patent number P4701382
Date of filing Feb 9, 2005
Date of publication of application Aug 24, 2006
Date of registration Mar 18, 2011
Inventor
  • (In Japanese)松岡 英明
  • (In Japanese)斉藤 美佳子
  • (In Japanese)佐々木 俊也
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京農工大学
Title METHOD OF PRODUCING MYOCARDIAL GRAFT AND MYOCARDIAL DIFFERENTIATION ACCELERATOR
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means for producing a myocardial graft which can be utilized in myocardial regeneration treatment from ES cells.
SOLUTION: A method for producing the myocardial graft from the ES cells includes the culture of the ES cells during differentiation induction under the presence of polyamine. Also, a myocardial differentiation accelerator for the ES cells contains the polyamine.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


胚性幹細胞(Embryonic Stem Cell:ES細胞)は、発生初期の胚(胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された末分化の細胞株である。ES細胞は、胚盤胞の内部細胞塊をマウス胎児線維芽細胞の初代培養細胞の単層シート上にまき、白血病阻害因子(Leukemia Inhibitory Factor:LIF)を添加して培養することにより得られる。ES細胞は内部細胞塊が有している未分化状態を維持したまま無限に増殖し、かつ多分化能を有する細胞である。従って、ES細胞を多能性幹細胞の状態で増殖させ、分化することによって得られた細胞や組織を用いることによって損傷した細胞や組織を修復するという、いわゆる移植治療が可能となる。これまで、ES細胞からドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、インスリン産生膵細胞、心筋細胞、造血幹細胞などへの分化誘導が報告されており、それぞれパーキンソン病、脊髄損傷、糖尿病、心筋梗塞、動脈硬化症などの治療への応用に関し、研究が進みつつある。



従って、個人のES細胞を維持管理しておき、必要に応じて、ES細胞から必要な細胞や組織を作製できるようにしておくことは、再生医療技術としての大きな要請である。ところが、ES細胞からの分化効率は一般に非常に低く、例えば心筋細胞の場合では、高々7%に過ぎない。よって、そのような低い分化効率であるがために、分化した心筋細胞のみを単離する必要があり、その操作は煩雑であり、実用的要請に応えられる状況ではない。



心筋梗塞、心筋症、心不全などの心臓疾患は、内科的薬物療法や外科手術が発達した現代でも生存率が低く、予後不良の疾患である。心筋細胞は、いったん損傷を受けると、骨格筋、肝臓、皮膚などとは異なって再生不能であるため、心臓移植が根治的治療となるが、慢性的なドナー不足という問題がある。従って、失われた心筋細胞を補充することにより心機能を回復させる心筋再生医療が、新しい根治的治療法として大いに期待される。



これまで心筋細胞への分化誘導因子として、例えば、ES細胞から心筋細胞への分化に効果を示すアスコルビン酸(非特許文献1)、心筋細胞へ分化誘導しやすい細胞株(p19細胞)について、これを心筋細胞へ分化させる効果を示すカルディオゲノール(非特許文献2)、ES細胞から心筋細胞への分化に効果を示す線維芽細胞成長因子(Fibroblast Growth Factor:EGF2)及び骨形態形成タンパク(Bone Morphogenetic Protein 2:BMP2)(非特許文献3)、骨髄間葉細胞から心筋細胞への分化に効果を示す5-アザシチジン(非特許文献4、5)、カエルのアニマルキャップ(胞胚の上にある未分化細胞の集団)から心筋細胞への分化に効果を示すアクチビン(非特許文献6)、ニワトリ胚から心臓形成に至る過程において特に形態形成に関与するHox遺伝子を誘導するレチノイン酸(非特許文献7)などが知られている。しかしながら、これらの分化誘導因子により得られるものは、いずれも単層の心筋細胞層までであり、移植材料として利用できるような多層筋線維構造の心筋組織は得られていない。これまで、心筋細胞シートと呼ばれる構造的にも機能的にも連結した心筋細胞からなる構造体を作製する方法が提案され、実用化もされている(非特許文献8)。この方法は、例えば高分子膜上で心筋細胞を培養して形成させた単層心筋細胞シートを、2層から5層、重ね合わせて多層化する方法であるが、細胞シートが単層ずつしか得られないため、より効率的な細胞シート形成条件が求められていた。また、出発物質が患者自身の心筋細胞であることから、その採取、維持管理が厄介であった。従って、ES細胞から心筋移植片として利用できる多層筋線維構造の心筋組織を作製することの要請は強い。



【非特許文献1】
T. Takahashi, B. Lord, P.C. Schulze, R.M. Fryer, S.S. Sarang, S.R. Gullans, R.T. Lee: Ascorbic Acid Enhances Differentiation of Embryonic Stem Cells into Cardiac Myocytes,Circulation, 107, 1912-1916 (2003)
【非特許文献2】
X. Wu, S. Ding, Q. Ding, N.S. Gray, P.G. Schultz: Small Molecules That Induce Cardiomyogenesis in Embryonic Stem Cells,J. Am. Chem. Soc., 126, 1590-1591 (2004)
【非特許文献3】
T. Kawai, T. Takahashi, M. Esaki, H. Ushikoshi, S. Nagano, H. Fujiwara, K. Kosai: Efficient Cardiomyogenic Differentiation of Embryonic Stem Cell by Fibroblast Growth Factor 2 and Bone Morphogenetic Protein 2, Circ. J., 68, 691-702 (2004)
【非特許文献4】
S. Makino, K. Fukuda, S. Miyoshi, F. Konishi, H. Kodama, J. Pan, M. Sano, T. Takahashi, S. Hori, H. Abe, J. Hata, A. Umezawa, S. Ogawa: Cardiomyocytes Can Be Generated from Marrow Stromal Cells in Vitro, J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)
【非特許文献5】
K. Fukuda: Development of Regenerative Cardiomyocytes from Mesenchymal Stem Cells for Cardiovascular Tissue Engineering, Artificial Organs, 25, 187-193 (2001)
【非特許文献6】
M. Logan, T. Mohun: Induction of Cardiac Muscle Differentiation in Isolated Animal Pole Explants of Xenopus laevis Embryos, Development, 118, 865-875 (1993)
【非特許文献7】
R.D. Searcy, K.E. Yutzey: Analysis of Hox Gene Expression during Early Avian Heart Development, Dev. Dyn., 213, 82-91 (1998)
【非特許文献8】
T. Shimizu, M. Yamato, T. Akutsu, T. Shibata, Y. Isoi, A. Kikuchi, M. Umezu, T. Okano: Electrically Communicating Three-dimensional Cardiac Tissue Mimic Fabricated by Layered Cultured Cardiomyocyte Sheets. J. Biomed. Mater. Res. 60, 110-117 (2002)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、心筋移植片の効率的な作製方法、及び心筋分化促進剤に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
分化誘導中のES細胞をスペルミンの存在下で培養することを含む、ES細胞から心筋移植片を作製する方法。

【請求項2】
 
下記の工程を含む、ES細胞から心筋移植片を作製する方法。
(a) ES細胞から浮遊培養によって胚様体を形成する工程
(b) 胚様体をスペルミンの存在下で培養する工程
(c) スペルミンを除去し、胚様体をさらに培養する工程

【請求項3】
 
ES細胞が、哺乳動物由来のES細胞である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれかに記載の方法によって得られる心筋移植片。

【請求項5】
 
心筋移植片が、単層若しくは多層構造の心筋細胞又は心筋組織である、請求項4に記載の心筋移植片。

【請求項6】
 
スペルミンを含有するES細胞に対する心筋分化促進剤。

【請求項7】
 
心筋移植片を作製するための、請求項6に記載の心筋分化促進剤。

【請求項8】
 
請求項6に記載の心筋分化促進剤を含む、心筋移植片作製用キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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17075_01SUM.gif
State of application right Registered
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