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(In Japanese)花き植物の作出方法 achieved foreign

Patent code P07S000042
Posted date Aug 31, 2007
Application number P2005-506301
Patent number P4314241
Date of filing Jan 16, 2004
Date of registration May 22, 2009
International application number JP2004000297
International publication number WO2004103065
Date of international filing Jan 16, 2004
Date of international publication Dec 2, 2004
Priority data
  • P2003-144406 (May 22, 2003) JP
Inventor
  • (In Japanese)橋本 文雄
  • (In Japanese)坂田 祐介
Applicant
  • (In Japanese)株式会社 鹿児島TLO
Title (In Japanese)花き植物の作出方法 achieved foreign
Abstract (In Japanese)本発明は、花色素生合成の遺伝を明らかにし、花きの花色遺伝と色素遺伝子型の関係を明らかにし、花きの新花色作出について実用的花色遺伝型交配法を提供するものであり、花色遺伝型が経路式(1)のフラボノイド生合成に関与し、フラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)やフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)の遺伝が五つの複対立遺伝子によって制御されているという新しい法則を見出し、結果として、遺伝子組み替え、放射線等照射などによる突然変異を起こさせる方法を用いなくても、花きの色素遺伝子型からその花色を自由に創成できる、遺伝子型D/d・E/e・HXHX・Pg/pg・Cy/cy・Dp/dpを用い、新花色を作出する方法である。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


アントシアニン類(anthocyanins)はフラボノイド化合物(flavonoids)の一種であり、植物の花、果実、葉などに広く存在し、赤、紫、青などの呈色に関係する色素配糖体(pigmentglycosides)である。アントシアニン類(anthocyanins)を塩酸で加水分解(hydrolysis)すると、糖部(sugars)とアグリコン部(aglycone)であるアントシアニジン(anthocyanidin)に分解される(非特許文献1、村上孝夫:天然物の構造と化学、廣川書店、1984年9月:170-172)。
フラボノール配糖体(flavonol glycosides)類はフラボノイド化合物(flavonoids)の一種であり、植物の花、果実、葉葉などに広く存在し、黄色に呈色する色素配糖体(pigmentglycosides)である。フラボノール配糖体類(flavonol glycosides)を塩酸で加水分解(hydrolysis)すると、糖部(sugars)とアグリコン部(aglycone)であるフラボノール(flavonol)に分解される(非特許文献2、村上孝夫:天然物の構造と化学、廣川書店、1984年9月:155-185)。
アントシアニジン(anthocyanidin)類は、植物の花において、フラバノン(flavanone)であるナリンゲニン(naringenin)を出発物質として生合成される。即ち、まずフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(flavonoid3’-hydroxylase,F3’、5’HまたはF3’H)の作用によりフラバノン骨格(flavanone skeleton)のB環(B-ring)に水酸基(hydroxylgroup)が更に1個結合したエリオディクティオール(eriodictyol)、更に2個結合したペンタハイドロキシフラバノン(pentahydroxyflavanone)へ酵素変換されることが知られている。また、出発物質であるナリンゲニン(naringenin)が、フラボノイド3-ヒドロキシラーゼ(flavonoid3-hydroxylase,F3H)の作用を受けジヒドロケンフェロール(dihydrokaempferol)へ酵素変換され、これが基質となって、更にフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)の作用を受け、B環に水酸基が更に1個結合したジヒドロクエルセチン(dihydroquercetin)、更に2個結合したジヒドロミリセチン(dihydromyricetin)へ酵素変換されることが知られている。この3種のジヒドロフラボノール(dihydrokaempferol、dihydroquercetin、dihydromyricetin)がジヒドロフラボノールリダクターゼ(dihydroflavonolreductase,DFR)およびアントシアニジンシンターゼ(anthocyanidin synthase,AS)の作用を受けて、それぞれペラルゴニジン(pelargonidin,Pgn)、シアニジン(cyanidin,Cyn)、デルフィニジン(delphinidin,Dpn)へ酵素変換されることが知られている(非特許文献2)。



アントシアニジン(anthocyanidin)類は、B環の水酸基が異なることでその呈色が決定される。例えば、一般に花色素(flowerpigment)で化学構造(chemical structure)中、B環の4’位(4’position)に水酸基が一個有るものはペラルゴニジン(Pgn)でオレンジ色~朱赤色を呈し、B環の3’、4’位に水酸基が二個有るものはシアニジン(Cyn)で赤色~深紅色を呈し、B環の3’、4’、5’位に水酸基が三個有るものはデルフィニジン(Dpn)で赤紫色~紫色を呈し、これらが共存することによって様々な花色を発現する(非特許文献3、本多利雄他:現代化学、1998年5月:25-32)。



これらの他、種々のアシル基(acylated groups)の結合したアントシアニン類(anthocyanin)も多数報告され、これらが分子間で互いにスタッキングして花色が変調する現象(分子間自己会合作用、intermolecularstacking)、他の黄色フラボノイド配糖体(flavonoid glycosides)類とサンドイッチ状にスタッキングして花色が変調(青色化、blueing)する現象(分子間コピグメント作用、intermolecular
copigmentation)、金属原子と結合することによって花色が変調(青色化、blueing)する現象(金属錯体イオン形成作用、metal-complexation)、分子中のアシル基(acylatedgroup)等が分子内でスタッキングして花色が変調(青色化、blueing)する現象(分子内コピグメント作用、intramolecular copigmentation)、並びに細胞液胞内pHが変化する現象などで花色が決定されることが認められている(非特許文献4、Goto、T.etal.:Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、30:17-33、1991)。



植物の花色遺伝は、花色自体(赤、青、黄、紫など)を遺伝子型(genotype)として捉えたものが多く報告されている(非特許文献5、安田齊:花色の生理・生化学、内田老鶴圃、1993年3月:P.219-272)。近年、フラボノイド色素(flavonoidpigments)に関する花色遺伝型の解析が試みられているが、これらはビール(Beale、1945)の唱えた1遺伝子-1酵素説(one gene-one enzymetheory)に基づくものである。その例として、ゼラニウム(Pelargoniumx hortorum)花弁のアントシアニジン生合成(anthocyanidinbiosynthesis)における、ジヒドロフラボノールリダクターゼ(DFR)およびアントシアニジンシンターゼ(AS)の酵素系をそれぞれE1/e1およびE2/e2と表記し、遺伝子型(genotype)を想定した方法がある(非特許文献6、小林加奈:育種学雑誌、48:169-176、1998)。また、ツツジでは、花弁中のフラボノイド生合成前駆体レベルでの各酵素系を遺伝子型として想定した方法があるが、ツツジ以外の花きには適用できなかったなどの問題点がある(非特許文献7、Heursel、J.とHorn、W.:Z.Pflanzenzuditg、79:2382 49、1977)。



また、ペチュニア(Petunia)の花では、Ht1とHt2の2遺伝子(gene)がフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)を、Hf1とHf2の2遺伝子がフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)を制御すると報告されている(非特許文献8、Holton、T.A.etal.:The Plant Cell、7:1071-1083、1995)。



更に、ペチュニアの花では、フラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)とフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)のB環の水酸化が二遺伝子支配を受けているとの記載がある(非特許文献9、Holton、T.A.etal.:Nature、366:27 62 79、1993)。本発明による花色遺伝型交配法では、一遺伝子の支配下にある五つの複対立遺伝子(multiple allele)で花色が制御されていることが特徴で、花きの花色素遺伝は、二遺伝子支配としては同定できなかった。



更にまた、ペチュニアの花では、遺伝子レベルでそれぞれの2遺伝子座が(Ht1、Ht2はフラボノイドB環の3’位の水酸化に関与し、Hf1、Hf2はフラボノイドB環の5’位の水酸化に)関与する事実を明らかにしたものの、色素遺伝子型(pigment
genotype)として後代にどの様な花色が遺伝するのか、必ずしも色素遺伝子型(pigment genotype)と花色の遺伝に相関性が認められなかったなどの問題点がある(非特許文献10、Griesbach、R.J.:J.Heredit.、87:241-245、1996)。



花色は、光が花弁表面にあたり、花弁表皮細胞内に存在する色素類(pigments)に吸収されなかった光が反射されることにより、人間の目に感知される。しかし、光、または色彩(chroma)に対する感受性に個人差があるために、花色を明確に表現する手法が必要であるとされてきた(非特許文献11、Voss、D.H.:HortSci.、27:1256-1260、1992)。



花色(flower color)は、色彩計、または、色差計(colorimeter)によるCIELab表色系(CIELabcolor coordinate system)を用いた測定方法が主流となってきた。これは、色の三属性(color attribute)、すなわち、色相(hue)、明度(lightness)、彩度(chromaまたはbrightness)を三次元の立体空間座標系(threedimentional global color chart)、つまり、色立体として考えたもので、本空間中の色差(hue difference)は、肉眼で感知した色の差を正確に反映する(非特許文献12、Gonnet、J.F.:FoodChem.、63:409-415、1998)。したがって、花色を測定、つまり測色して、花弁などの表皮細胞中の内生色素との関係を求める場合には、花色との関係をより正確に求めることができるなどの報告がある(非特許文献13、Hashimoto、F.etal.:J.Jpn.Soc.Hort.Sci.、69:428-434、2000;非特許文献14、Hashimoto、F.et al.:Biosci.Biotechnol.Biochem.、66:1652-1659、2002)。



その他、特開平5-184370号(以下、特許文献1という)に、フラボノイド水酸化酵素遺伝子(特許文献1の第0001~0002段落)の記載がある。「フラボノイド3’、5’-水酸化酵素活性を持つタンパク質をコードしているDNA鎖またはこのDNA鎖の任意の断片が提供される。このDNA鎖を目的植物に導入することにより、新しい色彩を有した品種を作出することができる。また本発明は、上記のDNA鎖またはこのDNA鎖の任意の断片を含有している組換えベクターにも関する」という記載がある(特許文献1の第0004段落)。



特開平10-113184号(以下、特許文献2という)には、フラボノイド配糖化酵素遺伝子(特許文献2の第0001~0008段落)の記載がある。「リンドウの花弁よりUDP-グルコース:フラボノイド3,5-O-グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を単離し、その配列決定をすることに成功し」、「ゲンチオデルフィン生合成遺伝子のうち、3位,5位の2位を配糖化しうる糖転移酵素遺伝子を提供することにある。」という記載がある(特許文献2の第0005段落)。



特開平11-509733号(以下、特許文献3という)には、植物における遺伝子発現調節のための組成物及び方法に関する特許請求の範囲1~15の記載がある。



第26回国際園芸学会議(トロント、カナダ)の講演要旨には、トルコギキョウ花弁中の3種の主要アントシアニジンの遺伝の記載がある(非特許文献15、Uddin、A.F.M.J.etal.:the XXVIth International Horticultural Congress and Exhibition、August 1 11 7:4754 76、2002)。この内容を、特願2003026598号(以下、特許文献4という)として出願し、トルコギキョウの花色遺伝型交配法(特許文献4の第0001~0019段落)と記載した。「トルコギキョウの主要花色素である、3つのアントシアニジン(anthocyanidin):ペラルゴニジン(pelargonidin、Pgn)、シアニジン(cyanidin、Cyn)、デルフィニジン(delphinidin、Dpn)の遺伝に着目し、自殖(self-pollination)や正逆交雑を行い検討した結果、F1~F3世代(progenies)の色素表現型(pigmentphenotype)の分離から、新しい遺伝の法則を見出した。」、「色素前駆体のB環の水酸化に関与するフラボノイド3’-ヒドロキシラーゼ(F3’H)とフラボノイド3’、5’-ヒドロキシラーゼ(F3’、5’H)の酵素反応系には、HT、HF、HD、HOの4つの複対立遺伝子(multipleallele)が存在し、これらが3’位の水酸化、5’位の水酸化、3’、5’位の水酸化、および3’位と3’、5’位の水酸化を制御し、」という記載がある。



US6080920号(以下、特許文献5という)には、花色変異(altered flower color)を起こさせた植物とその作出方法の記載がある。「本発明は、遺伝子改変植物(transgenicplants)を作出する新しい方法であって、花色変異(altered flower color)を起こさせるものである。より詳しくは、遺伝子改変カーネーション(transgeniccarnation plants)を作出する方法であって、自然のカーネーションにはない花色を表現できる方法である。」という記載がある。



DE19918365号(以下、特許文献6という)には、フラボン生合成酵素II(flavone synthaseII、FNSII)をコードする核酸(nucleic acid)を用いて花色変異(altered flower color)させた遺伝子改変植物(transgenicplants)の作出方法の記載がある。「フラボン生合成酵素II(flavone synthase II、FNSII)をコードする核酸(nucleic acid)であって、(i)1697塩基配列(basepair (bp) sequence)(1)であるもの、あるいは、その断片(fragments)、(ii)配列(sequence)が(1)へ混成(hybridize)するもの、または、あるいは、それと少なくとも40%の相同性(homology)を有するもので、かつ、FNSII活性を有するタンパク(protein)或いはポリペプチド(polypeptide)をコードし、または(iii)(i)あるいは(ii)と遺伝的に同等(geneticequivalent)である核酸。」、「(5)(I)または(Ia)を含む遺伝子改変植物(transgenic plants)であって、さらに、花色変異(alteredflower color)を起こした遺伝子改変植物(transgenic plants)の作出方法に関する。」という記載がある)。



このように、複対立遺伝子(multiple allele)については、その全容がまだ解明される必要があった。また、四つの複対立遺伝子(multipleallele)の存在を明らかにできたものの、遺伝される花色(flower color)との関係についての記載はなく、複対立遺伝子(multiple allele)の存在をすべて明らかにすると共に、花色(flowercolor)との関係をも明らかにする必要があった。



しかしながら、花色自体の遺伝子型育種法では後代花色の分離に曖昧なところが多く、実用化することに沢山の問題点を残した。また、非特許文献6に記載のある、E1/e1およびE2/e2で表されたゼラニウム(Pelargoniumxhortorum)花色素の遺伝についても、後代の分離比に疑問点が有り、実用化には至らなかった。特許文献においては、遺伝子組み替え、照射などによる突然変異を起こさせなければ、新花色を作出することができないという問題がある。



さらに、遺伝した個体がどの様な花色を有するか予測することが困難であって、その花色も肉眼による曖昧な色であり、問題がある。また、トルコギキョウではできたもののすべての花きに適用できるかどうか、CIELab表色系(CIELabcolor coordinate system)などを用いて花色(flower color)を正確に測色・数値化し、遺伝させることが十分ではなかったという問題点もある。



本発明は、花色素生合成の遺伝を明らかにし、花きの花色をCIELab表色系(CIELab color coordinatesystem)などを用いて花色(flower color)を正確に測色・数値化した上で、その色素遺伝子型(pigment genotype)と花色遺伝の関係を明らかにし、花きの新花色作出について実用的花色遺伝型交配法を提供するものである。



なお、全ての非特許文献及び非特許文献(すなわち、非特許文献1~15及び特許文献1~6)は、参考文献として本明細書に組み込まれる。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、花色遺伝型を適用した花きの新花色育種法に関する。より詳しくは、開花植物、すなわち、被子植物(angiosperms)の花と、遺伝子形を改変するための処理である交配の方法とからなる新規植物またはそれらを得るための処理に関するものである。また、生殖交雑(sexualhybridization)の段階を含む育種(breeding)によって得られた植物やその一部を用いる方法である。また、新規植物(new plants)またはそれらを得るための方法であって、被子植物(angiosperms)などの花き類(floweringplants)、特に花(flowers)に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
交配対象となる花き植物の主要アントシアニン色素表現型PgnCynDpn、CynDpn、Dpn、PgnCyn、Cyn、Pgnまたはnone型と、色素遺伝型を決定し、
決定した色素表現型と決定した色素遺伝型に基づいて作出したい花色を予測し、
予測した花色に基づいて交配する花き植物の花粉親と種子親とを選択し、そして、
選択した花粉親と種子親を交配することによって前記予測した花色と合致した花色を有する花き植物を作出する工程からなり、
前記色素遺伝型としてHXHX(式中、HXは、HT、HF、HD、HzまたはHOで示される5種類の対立遺伝子である)とPg/pg・Cy/cy・Dp/dpの両方を用いること、
特徴とする花き植物の作出方法

【請求項2】
 
下記に示す色素表現型と色素遺伝型との対応表:
【表1】
 


に基づいて、作出する花き植物の花色を予測することを特徴とする請求項1に記載の花き植物の作出方法

【請求項3】
 
色素遺伝型に加えて、さらに交配対象となる花き植物の遺伝子型D/d・E/e(式中、D/dは八重の花冠形質、E/eは覆輪の花冠形質を示す。)に基づいて作出したい花き植物の花形を予測することを特徴とする請求項1または請求項2に記載の花き植物の作出方法

【請求項4】
 
遺伝型が経路式(I)
【化1】
 


(式中、HT、HF、HD、HZ、HODp/dp、Pgn、Cyn、Dpnは、上記と同じ意義を有する)のフラボノイド生合成に関与し、遺伝することを特徴とする請求項第1項から請求項3のいずれか1項記載の花き植物の作出方法

【請求項5】
 
花色を作出する花色遺伝型交配の組み合わせを決定する早見表であって、花粉親の配偶子を行とし、種子親の配偶子を列とする複対立遺伝子の組み合わせ早見表に基づいて交配対象となる花き植物の色素遺伝型を決定することを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の花き植物の作出方法

【請求項6】
 
花色遺伝型交配の組み合わせから花きの花色を決定するものであって、花粉親の配偶子を行とし複対立遺伝子の組み合わせから花色を知ることのできる早見表を用いて作出したい花き植物の花色を予測することを特徴とする請求項1から請求項5のいずれか1項に記載の花き植物の作出方法

【請求項7】
 
前記花色の予測および作出した花色を色相角、明度および/または彩度として数値化することを特徴とする、請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の花き植物の作出方法
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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State of application right Registered
(In Japanese)公開特許は弊社ホームページ内で開示資料とともに、特許公報も掲載しております。
アドレスは http://www.ktlo.co.jp/002_seeds_.html


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