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METHOD FOR TRANSFORMING PLANT BELONGING TO GENUS COFFEA

Patent code P07A010475
File No. P01-3
Posted date Sep 14, 2007
Application number P2002-088758
Publication number P2003-274954A
Patent number P4016075
Date of filing Mar 27, 2002
Date of publication of application Sep 30, 2003
Date of registration Sep 28, 2007
Inventor
  • (In Japanese)荻田 信二郎
  • (In Japanese)佐野 浩
  • (In Japanese)小泉 望
  • (In Japanese)新名 惇彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
Title METHOD FOR TRANSFORMING PLANT BELONGING TO GENUS COFFEA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for transforming a plant belonging to the genus Coffea, by which the transformed adventive embryo of the plant can efficiently be induced and proliferated to produce the transformed plant belonging to the genus Coffea in a large amount.
SOLUTION: This method for transforming the plant belonging to the genus Coffea, comprising infecting the cut tissue pieces of the plant with an Agrobacterium bacterium to transduce the exogenote into the cells of the plant to obtain the transformed coffee is characterized by preliminarily culturing the cut tissue pieces in a culture medium containing phenylurea type cytokine, before infected with the Agrobacterium bacterium. The phenylurea type cytokinin which is a plant hormone is preferably 4-CPPU (N-2-chloro-4-pyridyl-N- phenylurea) or TDZ (thidiazlon).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


コーヒーに含まれるプリンアルカロイドの一種であるカフェインは、覚醒作用や心機能の増進といった効果を有する一方で、不眠・動機・めまいなどをきたす副作用を有する。そのため、カフェインレスコーヒーの需要が高く、従来は主に有機溶媒抽出など物理化学的な分離手法によりこれを生産していた。しかし、この方法では生産コストがかかる上に、コーヒー本来の味・香りが損なわれてしまう難点があり、新しいカフェインレスコーヒーの創出技術開発が望まれている。また、商業用コーヒー品種の多くは選抜された優良形質個体のモノカルチャーであり、高品質品種の需要は高い。さらに、病虫害や除草剤に高い抵抗性を示す新品種の創出も望まれている。



コーヒー属植物の育種は、元来、交配による優良品種の選抜、種子繁殖あるいは接木による増殖を主流としている。しかし交配選抜による育種は長い年月を要し、コーヒー種子は貯蔵条件により急激に発芽率低下をきたす。接木による増殖は優良形質品種のクローン増殖に有効であるが、広い育種場の確保や台木の更新などが必要となる。



その後、選抜・交配育種に替わるコーヒー属植物の育種技術として組織培養技術が開発されてきた(Staritsky, Acta Bot Neerl, 19: 509-514, 1970; Berthouly and Etienne, Somatic Embryogenesis in Woody Plants, Vol. 5, Kluwer: 259-288, 1999)。この技術によれば、栄養成分や植物ホルモンなど植物の成長を制御する物質を組み合わせた至適な培地中でコーヒー属植物の一部組織(例えば葉の切断組織片)を培養することにより、多数の植物体を得ることができる。近年、遺伝子組換え技術により形質転換植物を創出することが可能になり、コーヒー属植物においても形質転換例が幾つか報告されている(Spiral et al., Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.44, Transgenic Trees, Springer-Verlag: 55-76, 1999)。これによると、コーヒー属植物の形質転換法は、主に、最初に▲1▼カルス、▲2▼不定胚形成細胞(不定胚を形成する能力のある細胞であって、通常はエンブリオジェニックカルス、あるいはエンブリオジェニックセルなどと定義される)、あるいは▲3▼不定胚と呼ばれる培養細胞塊(▲1▼から▲3▼を総称する用語として定義される)を誘導し、次にこれを充分量増殖させ、その後アグロバクテリウム法により形質転換を行い、形質転換細胞を選抜した後に、形質転換植物を得る。この方法は、植物体分化能力の高い培養細胞塊誘導・増殖の難易、すなわち材料によって誘導・増殖率がばらつくこと(Berthouly and Michaux-Ferriere, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 169-176, 1996)や、培養細胞塊の誘導・増殖に時間がかかること、さらに形質転換効率に左右されること等のため、必ずしも実用的な方法とは言えない。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、コーヒー形質転換方法に関し、より詳しくはコーヒー属植物の形質転換不定胚を効率的に誘導し増殖させて、形質転換コーヒー属植物を大量に創出する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 コーヒー属植物の切断組織片をアグロバクテリウム細菌に感染させて外来遺伝子を導入することにより形質転換コーヒーを得るに当たり、アグロバクテリウム細菌感染の前に、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地で切断組織片を前培養することを特徴とするコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項2】
 フェニルウレアタイプのサイトカイニンが4-CPPU(N-2-クロロ-4-ピリジル-N-フェニルウレア)またはTDZ(チジアズロン)である請求項1記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項3】
 コーヒー属植物がコーヒー・アラビカ種(Coffea arabica)、コーヒー・カネフォラ種(Coffea canephora)、コーヒー・リベリカ種(Coffea liberica)またはコーヒー・デウェブレイ種(Coffea dewevrei)である請求項1または2記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項4】
 切断組織片が葉の切断組織片である請求項1~3のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項5】
 培地がMS培地、B5培地またはそれらの改変培地である請求項1~4のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項6】
 培地中のフェニルウレアタイプのサイトカイニンの濃度が0.1~40μMである請求項1~5のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項7】
 前培養を5~30日行う請求項1~6のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
【請求項8】
 さらに、フェニルウレアタイプのサイトカイニンを加えた培地、または、フェニルウレアタイプのサイトカイニンおよびオーキシンを加えた培地に切断組織片を移植して培養する請求項1~7のいずれかに記載のコーヒー属植物の形質転換法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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