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METHOD FOR ASSAYING PROTEASE ACTIVITY USING POLYMER MEMBRANE

Patent code P07A010512
File No. P03-44
Posted date Sep 14, 2007
Application number P2004-073625
Publication number P2005-253436A
Patent number P4505630
Date of filing Mar 15, 2004
Date of publication of application Sep 22, 2005
Date of registration May 14, 2010
Inventor
  • (In Japanese)塩坂 貞夫
  • (In Japanese)田村 英紀
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
Title METHOD FOR ASSAYING PROTEASE ACTIVITY USING POLYMER MEMBRANE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for assaying protease (preferably neuropsin) activity in high sensitivity with a very smaller amount of a sample than that of a conventional solution method.
SOLUTION: This method for assaying protease activity comprises (a) a process for adhering a protease-containing sample to a polymer membrane, (b) a process for reacting a protease with a protease specific synthetic substrate on the membrane and (c) a process for assaying a signal produced by reaction between the protease and the substrate.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


従来、酵素活性を測定するために、特異抗体を用い、免疫沈降産物について試験管内で合成基質を反応させて切断される基質蛍光を測定するか、ELISA法によりそのタンパク質量を測定するかのいずれかの方法が主に用いられていた。しかし、いずれの方法についても50~100マイクロリッターの量のサンプル量が必要となり、しかも感度が低いのが欠点であった。プロテアーゼ活性の測定のためには、プロテアーゼタンパク質または組織ホモゲネートを、プロテアーゼ特異抗体をコートしたチューブまたはウェル内に分注し、結合したプロテアーゼを定量するELISA法、あるいはプロテアーゼ特異的抗体により免疫沈降したプロテアーゼを基質と混合することによりプロテアーゼ反応を開始し、適当な時間に合成基質の切断によって生ずる蛍光(MCA)を測定する方法のいずれかが主に用いられてきた。



プロテアーゼは、ペプチド鎖のペプチド結合を加水分解する酵素群の総称であり、種々の生体機能に関与することが知られている。最近の研究により、脳におけるセリンプロテアーゼの重要な役割が明らかになってきた。例えば神経の可塑性におけるプラスミノーゲンアクチベータやエキサイトトキシン(exitotoxin)による神経損傷などである。ニューロプシンは、当初マウスの海馬から単離されたセリンプロテアーゼであるが、生化学的な分析により、ニューロプシンが実際にはトリプシン様の基質特異性を持つタンパク質分解活性を持つことが明らかになった。さらに、ニューロプシンに特異的な抗体は、興奮によって引き起こされるてんかん発作の進行を引き延ばした。ニューロプシンのmRNAの量は化学的に誘導された虚血性障害の後の記憶の保持能力に関係している。このタンパク質はまた、長期増強の誘導をも調節する。このことから、ニューロプシンは神経の可塑性において重要な役割を担っている。さらに、ニューロプシンのmRNAは脳や皮膚、発達途中の妊婦の子宮といった多様な臓器において発現されている(特開平11-318461)。



ニューロプシンは、その配列相同性からカリクレインファミリーのメンバーであると考えられている。カリクレインは、キニノーゲンを活性化し生理活性物質キニンへの変換を行うプロテアーゼとして研究されてきたタンパク質である。ニューロプシンは、学習機能に関与すると考えられているが、その詳細なメカニズムは明らかにされていない。



このようなプロテアーゼの生体機能への関与を調査するためには、簡便かつ高感度のプロテアーゼ活性測定法が必要である。ELISA法は、タンパク質量を測定できるにすぎないので、そのタンパク質の発現を確認することができても、そのタンパク質がどのような状態で(活性化状態であるか不活性化状態であるか)その部位に存在するのかまで知ることができない。従って、ELISA法では、そのプロテアーゼが、生体機能にどのように関与しているかを正確に知ることができない。また、特異抗体を用いて組織ホモゲネートから目的のプロテアーゼを精製し、合成基質を用いてその活性を測定する方法は、抗体を使用する必要があるので、特異性は高いものの非常に手間がかかる上に、感度も満足のいくものではない。
【特許文献1】
特開平11-318461

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、新規のプロテアーゼ活性測定法に関する。より詳細には、本発明は、ポリマー膜上に目的のプロテアーゼ(好ましくは、カリクレインファミリープロテアーゼ)を付着させ、膜上で活性を測定することを特徴とする、新規のプロテアーゼ活性測定法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
カリクレインファミリープロテアーゼ活性を測定する方法であって、
カリクレインファミリープロテアーゼを含有するサンプルを疎水性ポリマー膜上に付着する工程、
カリクレインファミリープロテアーゼと該カリクレインファミリープロテアーゼ特異的合成基質とを該膜上で反応させる工程、および
カリクレインファミリープロテアーゼと該基質との反応により生じるシグナルを測定する工程、
を包含する、方法。

【請求項2】
 
カリクレインファミリープロテアーゼ活性を測定する方法であって、
組織切片をポリマー膜と接触させて、該組織から分泌されるカリクレインファミリープロテアーゼを該膜上に付着する工程、
カリクレインファミリープロテアーゼと該カリクレインファミリープロテアーゼ特異的合成基質とを該膜上で反応させる工程、および
カリクレインファミリープロテアーゼと該基質との反応により生じるシグナルを測定する工程、
を包含する、方法。

【請求項3】
 
前記カリクレインファミリープロテアーゼが、ニューロプシンである、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
前記疎水性ポリマー膜が、PVDF膜である、請求項3に記載の方法。

【請求項5】
 
前記合成基質が、Val-Pro-Arg-(4-メチルクマリル-7-アミド)(VPR-MCA)である、請求項3または4に記載の方法。

【請求項6】
 
卵巣癌、皮膚癌、子宮頸癌および乾癬症からなる群より選択される少なくとも1つの疾患を診断するためのキットであって:
a)疎水性ポリマー膜;および
b)ニューロプシン特異的合成基質であって、ニューロプシンとの酵素反応により検出可能なシグナルを生じるよう標識された基質、
を備え、ここで、上昇したレベルのニューロプシン活性の検出は、被験体が該疾患を有することの指標となる、キット。

【請求項7】
 
前記カリクレインファミリープロテアーゼが、ロイペプチンの存在下で調製される、請求項1ないし請求項5のいずれか1項に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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17282_01SUM.gif
State of application right Registered
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