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IMMUNOLOGICAL DYEING METHOD AND CELL EVALUATION METHOD UTILIZING IT commons

Patent code P07A010694
Posted date Oct 4, 2007
Application number P2005-319965
Publication number P2007-127505A
Patent number P4734636
Date of filing Nov 2, 2005
Date of publication of application May 24, 2007
Date of registration May 13, 2011
Inventor
  • (In Japanese)蓮井 和久
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 鹿児島大学
Title IMMUNOLOGICAL DYEING METHOD AND CELL EVALUATION METHOD UTILIZING IT commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an immunological dyeing method capable of evaluating the propagation of cells or the like while achieving the suppression of the non-specific reaction due to intrinsic biotin or the like without lowering detection sensitivity.
SOLUTION: The immunological dyeing method is composed of a step of suppressing intrinsic peroxidase activity with respect to the sample in a fixed sample cut piece, a step of hydrophilizing the suppressed sample, a step of restoring the antigenecity of the hydrophilized sample, a step of bonding a part of the sample to a primary antibody. As an antigenecity restoring step, at least one kind of treatment selected from enzymatic treatment and heat treatment.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年の免疫科学の進歩により、抗原抗体反応を用いて微量の物資を感度良く検出する免疫測定が広く用いられている。免疫測定の中で一般的なものとして、免疫組織染色及び酵素免疫測定がある。



免疫組織染色とは、組織上の特定の抗原を、その抗原を特異的に認識する抗体によって検出する方法である。通常、組織を固定後パラフィン包埋したブロックから薄切した切片上に特定の抗原を認識する抗体を反応させ、反応した抗体の有無から抗原の存在を判断する。最初に抗原と反応させる抗体を、通常、第一抗体と呼ぶ。第一抗体に、視覚又は機器により検出し得るシグナルを発する物質を結合させておけば、そのシグナルの強度から第一抗体の量がわかり、それは即ち切片上の抗原の量に対応する。この目的を達成するためのシグナルを発する物質として蛍光物質、酵素などが挙げられる。



光学顕微鏡での染色像の解析が可能となった現在では、シグナルを発する物質として酵素を用いるのが一般的となった。免疫組織染色を行なう際、第一抗体に酵素を結合させておけば、その酵素の発色性の基質を加えることにより酵素活性に対応した発色が得られ、それは抗体の量に対応、即ち組織上に存在する抗原の量に対応する。しかし、この方法では通常十分な感度が得られない。



抗原を検出する免疫組織化学的染色方法には、一次抗体を可視化できる酵素や標識物で標識したものを用いる直接法と一次抗体を標識せずに二次抗体を標識する間接法があることが知られている。(酵素抗体法 学際企画 20002.2.18発刊、p.23-25(以下、非特許文献1という))。一般に、間接法には、抗原を一次抗体で標識した後に、この特異抗体を標識する間接法に属するペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法(以下、PAP法という)、ストレプトアビチンービオチン複合体法(以下、sABC法という)、二次抗体と標識酵素とのポリマーへ結合させたポリマー試薬法、FITCで標識した一次抗体ないし二次抗体をHRP標識抗FITC抗体を用いる方法、sABC法に異化レポーター沈着反応(以下、CARDという)を追加した超高感度の免疫組織化学的染色方法がある。



【非特許文献1】
改訂四版 渡辺・中根 酵素抗体法 名倉宏、長村義之、堤寛編 学際企画 20002.2.18発刊

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、免疫染色法、及び当該免疫染色法を利用した細胞の評価方法に関し、特に、特に、酵素処理を利用した免疫染色法、及び当該免疫染色法を利用した細胞の評価方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
動物組織の形態の形成及び維持を免疫組織染色によって解析するにあたり、
(a)動物組織の試料を、内因性ペルオキシダーゼ活性抑制処理の後に親水化する工程、
(b)前記試料を、前記試料の抗原性を回復させるために、酵素処理及び熱処理からなる群より選ばれる少なくとも1種の抗原回復処理を行う工程、
(c)一次抗体を前記試料中の抗原と結合させる工程であって、前記抗原と前記一次抗体との反応の前に非特異反応抑制処理を行う工程、
(d)二次抗体、担体及び標識酵素を備えるポリマー複合体を、前記一次抗体と結合させる工程であって、前記一次抗体と前記ポリマー複合体との反応の前に非特異反応抑制処理を行う工程、
(e)前記標識酵素を用いて、前記抗原を可視化させ検出する工程であって、可視化反応の前に非特異反応抑制処理を行う工程
(f)前記標識酵素を用いて、異化レポーター沈着反応を追加して行う工程であって、前記異化レポーター沈着反応前に非特異反応抑制する処理を行う工程であって、前記抗原を可視化させ検出する工程、及び
(g)(e)での可視化の結果と(f)での可視化の結果とを比較する工程
を具え、前記一次抗体は、ベクリン-1(Beclin-1)、CD133、及びCD117からなる群より選ばれる少なくとも1種の抗原の抗体が用いられるか、又はそれらの少なくとも2つの抗体のパネルが用いられる、動物組織の形態の形成及び維持を解析する方法。

【請求項2】
 
前記動物組織の試料は化学固定包埋標本の切片である、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
前記動物組織はヒト組織である、請求項1又は2記載の方法。

【請求項4】
 
動物組織における細胞増殖、幹細胞の動態及び細胞死からなる群より選ばれる少なくとも1種の細胞状態の評価を行なう、請求項1~3の何れか1項記載の方法。

【請求項5】
 
動物組織における幹細胞の供給を評価するため、一次抗体として、CD117又はCD133の抗体の外、CD34の抗体、又はそれらの少なくとも2つの抗体のパネルを用い、多分化能幹細胞から組織幹細胞へ分化途中の細胞を標識する、請求項1~4の何れか1項記載の方法

【請求項6】
 
動物組織における細胞の自己貪食又は自己貪食死を評価するため、一次抗体として、ベクリン-1又はCD133の抗体又はそれらの少なくとも2つの抗体のパネルを用い、自己貪食又は自己貪食死を示す細胞を標識する、請求項1~4の何れか1項記載の方法

【請求項7】
 
動物組織における細胞の分泌機能を評価するため、一次抗体として、ベクリン-1又はCD133の抗体又はそれらの少なくとも2つの抗体のパネルを用い、分泌に関与する成分を標識する、請求項1~4の何れか1項記載の方法

【請求項8】
 
動物組織における組織形成を解析するため、一次抗体として、CD117、ベクリン-1、又はCD133の外、Ki-67又はクリーブドカスパーゼ-3の抗体又はそれらの少なくとも2つの抗体のパネルを用い、細胞増殖、幹細胞の動態及びアポプトーシス又は自己貪食若しくは自己貪食細胞死からの組織の再生を評価する、請求項1~4の何れか1項記載の方法

【請求項9】
 
前記酵素処理は、トリプシン、プロナーゼ及びプロテイナーゼKからなる群より選ばれる少なくとも1種の酵素による処理である、請求項1~8の何れか1項記載の方法

【請求項10】
 
前記酵素処理は、前記酵素による処理を1~30分間行う処理である、請求項9記載の方法

【請求項11】
 
前記熱処理は、前記切片をクエン酸緩衝溶液又はEDTA溶液のいずれかの溶液に浸漬して加熱する処理である、請求項1~10の何れか1項記載の方法

【請求項12】
 
前記熱処理は、pH6~8を有する前記クエン酸緩衝溶液による処理である、請求項11記載の方法

【請求項13】
 
前記非特異反応抑制処理は、二次抗体と同種の動物血清による処理、ウシ血清アルブミンによる処理、スキムミルクによる処理、ノンファットミルクによる処理及びカゼイン溶液による処理からなる群より選ばれる少なくとも1種の処理である、請求項1~12の何れか1項記載の方法。

【請求項14】
 
前記非特異反応抑制処理は、0.025~2.5%の範囲のカゼインを含むカゼイン溶液による処理であるか、又は0.5~5%の範囲のウシ血清アルブミンを含むウシ血清アルブミン溶液による処理である、請求項13記載の方法

【請求項15】
 
前記標識酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項1~14の何れか1項記載の方法
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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17519_01SUM.gif
State of application right Registered
(In Japanese)公開特許は弊社ホームページ内で開示資料とともに、特許公報も掲載しております。
アドレスは http://www.ktlo.co.jp/002_seeds_.html


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