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NOVEL PRIMER FOR SYNTHESIZING FUNCTIONAL ENZYME POLYMERIZATION AMYLOSE DERIVATIVE

Patent code P07A012160
File No. P04-016
Posted date Dec 21, 2007
Application number P2004-123063
Publication number P2005-306748A
Patent number P4774506
Date of filing Apr 19, 2004
Date of publication of application Nov 4, 2005
Date of registration Jul 8, 2011
Inventor
  • (In Japanese)秋吉 一成
  • (In Japanese)森本 展行
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 東京医科歯科大学
Title NOVEL PRIMER FOR SYNTHESIZING FUNCTIONAL ENZYME POLYMERIZATION AMYLOSE DERIVATIVE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To particularly obtain a novel primer for synthesizing amylose obtained by modifying the reducing end of maltopentose with a compound having a terminal amino group or hydrazide group.
SOLUTION: As the synthetic primer for amylose as an interesting polymer host which selectively incorporates a hydrophobic molecule therein by its spiral formation, an amphiphilic primer is synthesized by introducing a maltopentose group into a hydrophobic long-chain alkyl group or a phospholipid. Further, a novel polymerizable primer for obtaining an amphiphilic synthetic polymer-amylose hybrid is synthesized. Furthermore, a thiol reactive primer for synthesizing a protein amylose hybrid, an intercalator substituted primer for synthesizing a hybrid with a nucleic acid, and a basic polymer (polylysine, polyarginine, or the like) substituted primer are disclosed.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


多糖には螺旋形成が可能なものがあり、その一つがアミロースである。アミロースはグルコース残基がα-1,4結合で結びついた直鎖状のものである。結晶状態では主にヘリックス構造を有しているA, B, Vなど種々の形態が知られている(非特許文献1、2)。水溶液中においては通常、アミロースは局所的に不規則な螺旋性を持つ可能性があるがほぼランダムコイル状であると言われている(非特許文献3~5)。しかし、アミロースの周りに疎水性分子が存在するとコンフォメーションが大きく変わり、アミロース主鎖はゲストの大きさに応じて6~8グルコース残基で一周の螺旋を巻きその疎水性分子を包接する。
このようにアミロースは高分子ホストとして期待される物質であるが、溶液中では老化と呼ばれる凝集や沈殿しやすい性質があり、これはアミロース分子間での二重螺旋形成によって螺旋表面の親水性領域が減少するためである(非特許文献6)。このときアミロース主鎖も歪みを伴って引き延ばされ、分子全体としてコンパクトな状態となり、螺旋内部に物質を取り込めるような空間がなくなってしまう。また、アミロースの包接複合体も沈殿しやすい性質がある。
ホスホリラーゼ (EC 2. 4. 1. 1) はα-1, 4-グルカン鎖を非還元末端から順次加リン酸分解してa-D-グルコース-1-リン酸 (G-1-P) をつくる酵素であるが(非特許文献7)、反応が可逆的であり、糖鎖中のグリコシド結合と分解生成物中のリン酸エステル結合が同程度のポテンシャルを有しているため、平衡の著しいかたよりはなく、G-1-Pから高分子量のα-1,4-グルカン鎖を合成することも可能である。動物臓器の中でホスホリラーゼの含量が高い筋肉と肝臓の細胞内ではG-1-Pの濃度に比べて無機オルトリン酸 (Pi) の濃度が高いので、この酵素は生理的にはグリコーゲン分解の方向に働いている。
動物ホスホリラーゼは二重の活性調節性(アロステリック調節とリン酸化・脱リン酸化による調節)を持つことで知られるが、ジャガイモやトウモロコシのような高等植物組織から精製されたホスホリラーゼは常に活性型として存在することから酵素合成に適していると言える。
一方、基質グルカンに対する特異性もホスホリラーゼの起源によって大きく異なる。ウサギ筋肉ホスホリラーゼはグリコーゲンやアミロペクチンのような枝分かれを持つα-グルカンを良い基質とするが、直鎖のアミロースにはうまく働かない。それに対してジャガイモのホスホリラーゼはアミロペクチン、アミロースなどをほぼ同程度の良い基質とするが、グリコーゲンに対する親和性は非常に低い。
ジャガイモホスホリラーゼを用いた酵素合成によってアミロースを得る手法は古くから用いられてきた。1954年、Whelanらはこの反応ですべてのプライマーで反応が同じ速度で進行することや、マルトテトラオースより長いプライマーを用いることによって反応が効果的に進行することを明らかにした(非特許文献8)。その後、得られるアミロースの分子量分布が非常に狭いことや、反応条件をうまく合わせることによって重合度を制御できるということも分かった。更にこの反応がアミロースの非還元末端側から合成が進行することから、1987年、Ziegastらはアミロースオリゴマーの還元末端側を修飾したものをプライマーに用いて種々のアミロース誘導体を合成した(非特許文献9)。その後、酵素合成の手法を用いた様々なアミロース誘導体が合成されている(非特許文献10~15)。
本発明者はアミロースの高分子ホストとしての機能を利用することを目的とし、ポリエチレンオキシド (PEO) とアミロースがA-B型に結合したPEO-アミロース の合成に成功した(非特許文献17、18)。PEOは両親媒性の高分子で、水及び種々の有機溶媒に可溶である。このため種々の合成高分子の基盤材料として用いられているほか、タンパク質の機能化にも用いられている。このPEO-アミロースは水溶液中での溶解性が向上し、クロロホルムなどの有機溶媒にも溶解することが明らかとなっている。PEGは両親媒性の高分子で、水および有機溶媒に可溶である。このPEGを有するPEG-アミロースは水溶液中での溶解性が向上し、クロロホルムなどの有機溶媒にも溶解することが明らかとなっている。またクロロホルム中にてアミロースを内核とするミセルを形成し、特異な包接挙動を示すことを明らかにしてきた(非特許文献16、17)。
【非特許文献1】
Wu, H.-C. H.; Sarko, A. Carbohydr. Res. 1978, 61, 7-25.
【非特許文献2】
Wu, H.-C. H.; Sarko, A. Carbohydr. Res. 1978, 61, 27-40.
【非特許文献3】
Kitamura, S.; Yunokawa, H.; Kuge, T. Polym. J. (Tokyo) 1982, 14, 85-91.
【非特許文献4】
Kitamura, S.; Yunokawa, H.; Mitsuie, S.; Kuge, T. Polym. J. (Tokyo) 1982, 14, 93-99.
【非特許文献5】
Ebert, B.; Elmgren, H. Biopolymers 1984, 23, 2543-2557.
【非特許文献6】
Immel, S.; Lichtenthaler, F. W. Starch/Staerke 2000, 52, 1-8.
【非特許文献7】
福井俊郎; 中野憲一 化学と生物 1985, 23, 357-365.
【非特許文献8】
Whelan, W. J.; Bailey, J. M. Biochem. J. 1954, 58, 560.
【非特許文献9】
Ziegast, G.; Pfannemueller, B. Carbohydr. Res. 1987, 160, 185-204.
【非特許文献10】
Braumuhl, V. v.; Jonas, G.; Stadler, R. Macromolecules 1995, 28, 17-24.
【非特許文献11】
Enomoto, N.; Furukawa, S.; Ogasawara, Y.; Akano, H.; Kawamura, Y.; Yashima, E.; Okamoto, Y. Anal Chem. 1996, 68, 2798-2804.
【非特許文献12】
Kobayashi, K.; Kamiya, S. Macromolecules 1996, 29, 8670-8676.
【非特許文献13】
Loos, K.; Stadler, R. Macromolecules 1997, 30, 7641-7643.
【非特許文献14】
Loos, K.; Braumuhl, V. v.; Stadler, R. Macromol. Rapid Commun 1997, 18, 927-938.
【非特許文献15】
Kamiya, S.; Kobayashi, K. Macromol. Chem. Phys 1998, 199, 1589-1596.
【非特許文献16】
Akiyoshi, K.; Kohara, M.; Ito, K.; Kitamura, S.; Sunamoto, J. Macromol. Rapid Commun. 1999, 20, 112-115.
【非特許文献17】
K. Akiyoshi, N. Maruichi, M. Kohara, Shinichi Kitamura, Biomacromolecules, 3,280-83 (2002).
【非特許文献18】
稲田祐二ほか タンパク質ハイブリッド 共立出版

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、アミロース合成用プライマーに関するものである。さらに詳しくは、マルトペンタオースの還元末端を末端アミノ基又はヒドラジド基を有する化合物で修飾してえられるアミロース合成用プライマーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
式2で表されるアミロース合成用プライマー;
式2
【化2】
 


(式中Rは、炭素数5~30のアルキル基)

【請求項2】
 
アルキル基がヘキサデシル基、ドデシル基、又はオクチル基である請求項1に記載のアミロース合成用プライマー。

【請求項3】
 
式3で表されるアミロース合成用プライマー;
式3
【化21】
 


(式中C(=O)R2、C(=O)R3は、炭素数10~30の脂肪酸残基)

【請求項4】
 
C(=O)R2及びC(=O)R3がパルミトイル基である請求項3に記載のアミロース合成用プライマー。

【請求項5】
 
式4で表される化合物;
式4
【化22】
 


(式中Aは炭素数1~10の脂肪族炭化水素基)

【請求項6】
 
Aがエチレン基である請求項5に記載の化合物。

【請求項7】
 
請求項5または6の化合物と、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、N-イソプロピルアクリルアミド、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸、アクリル酸、N-ビニルピロリドン、アクリルアミド、及び2-アミノエチルメタクリレートから選ばれるメタクロイル型モノマーとの共重合体。

【請求項8】
 
メタクロイル型モノマーが2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)である請求項7に記載の共重合体。

【請求項9】
 
請求項7または8に記載の共重合体からなるアミロース合成用プライマー。

【請求項10】
 
請求項1~9のいずれか一に記載のアミロース合成用プライマー、化合物、又は共重合体を用いた機能性酵素重合アミロースの製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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19145_22SUM.gif
State of application right Registered
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