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METAL ION-RESPONDING FLUORESCENT PROTEIN meetings

Patent code P07P005911
Posted date Mar 28, 2008
Application number P2006-247008
Publication number P2008-067613A
Patent number P5181170
Date of filing Sep 12, 2006
Date of publication of application Mar 27, 2008
Date of registration Jan 25, 2013
Inventor
  • (In Japanese)田中 俊樹
  • (In Japanese)水野 稔久
  • (In Japanese)村尾 香織
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 名古屋工業大学
Title METAL ION-RESPONDING FLUORESCENT PROTEIN meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a metal ion-responding fluorescent protein recognizing the presence of a metal ion and/or its concentration by detecting the metal ion and developing its fluorescence.
SOLUTION: Disclosed is a metal ion-responding fluorescent protein comprising a metal ion-responding site and a fluorescent site, wherein the fluorescent site develops fluorescence by that the metal ion bonds to the metal ion-responding site.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


金属イオンは生体内(細胞内)において重要な役割を果たしている。これは、細胞内におけるスーパーオキシドジスムターゼに代表されるほとんどの酸化酵素において、反応中心の補因子として用いられている事からも明らかである。しかしながら一方で、必要以上の金属イオン濃度は毒として働くことも知られており、細胞内のそれぞれのオルガネラ膜における金属イオン膜透過性は、厳密に制御されている。大腸菌細胞膜におけるニッケルイオン(Ni2+)膜輸送タンパク質として知られるNikABCDEは、ニッケルイオン濃度に依存したDNA結合リプレッッサータンパク質であるNikRによりその発現量が制御されている事が知られている。



上記一例において、細胞の特定部位に特定の濃度で金属イオンが存在している点が重要である。従って、細胞内の特定部位における金属イオンの存否確認をすること及び/又はその金属イオンの濃度を検知することは、生体機能の解明しいては医薬品の開発等に重要である。ゆえに、それら目的を達成し得る生体分析資材が求められている。



以下に生体内(細胞内)における金属イオンの分析に関する文献を示す。



文献1及び2には、亜鉛イオンを特異的に捕捉して蛍光を発する亜鉛蛍光プローブである有機低分子が記載されている。文献1及び2は、亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、捕捉後の錯体の蛍光強度に優れ、長波長の励起光で蛍光測定を行なうことにより細胞障害を回避することができる亜鉛蛍光プローブとして利用可能な化合物を提供することを課題としている。



また、細胞内の特定部位における金属イオン(カルシウムイオン)の分析に関する文献として文献3がある。文献3には、好中球細胞内のカルシウムイオンの濃度変化をもたらす複数の経路を同定し、かつ各経路におけるカルシウムイオンの濃度変化を個別に測定する方法が記載されている。文献3は、3種類の経路を、カルシウムイオンキレート剤(EGTA)を細胞外液に添加することと、細胞内カルシウムイオンチャネルの機能を特異的に阻害する化合物(TMB-8)で細胞を処理することとを使い分けることにより、選択的に1つのカルシウムイオン動員経路を機能させ、各経路でのカルシウムイオン濃度変化を個別に測定し定量することを可能とするとしている。



文献4には、カルシウムイオンの量に依存した蛍光を発することができる蛍光タンパク質が記載されている。文献4は、色が異なる2種の緑色蛍光タンパク質(GFP)を使用した蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)の利用により、常温(特に37℃)においてカルシウムイオン濃度を定量化するための指示薬として使用できる蛍光タンパク質を提供することを課題としている。
【特許文献1】
再表01/062755
【特許文献2】
特開2000-239272
【特許文献3】
特開2000-338045
【特許文献4】
特開2002-253261

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、金属イオン応答性蛍光発色タンパク質に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
N末端からC末端方向に以下のアミノ酸配列(1)から(8)を順番に有するタンパク質からなる金属イオン応答性蛍光発色タンパク質であって、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち40番目から67番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(1)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち68番目から87番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(2)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち88番目から115番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(3)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち116番目から119番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(4)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち120番目から167番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(5)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち168番目から172番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(6)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち173番目から363番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(7)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち364番目から370番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(8)であり、配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち371番目から398番目までのアミノ酸配列がアミノ酸配列(9)である金属イオン応答性蛍光発色タンパク質
(1)金属イオン応答性部位を構成する両親媒性ペプチドのアミノ酸配列。
(2)リンカーを構成するアミノ酸配列。
(3)金属イオン応答性部位を構成する両親媒性ペプチドのアミノ酸配列。
(4)リンカーを構成するアミノ酸配列。
(5)蛍光発色部位を構成する蛍光発色タンパク質のN末端から数えてn+1番目からC末。
端までのアミノ酸配列。
(6)リンカーを構成するアミノ酸配列。
(7)蛍光発色部位を構成する蛍光発色タンパク質のN末端から数えて1番目からn番目までのアミノ酸配列。
(8)リンカーを構成するアミノ酸配列。
(9)金属イオン応答性部位を構成する両親媒性ペプチドのアミノ酸配列。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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