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MOLECULE RECOGNIZING AGE

Patent code P08A013322
Posted date Apr 18, 2008
Application number P2006-081807
Publication number P2007-254397A
Patent number P5093711
Date of filing Mar 23, 2006
Date of publication of application Oct 4, 2007
Date of registration Sep 28, 2012
Inventor
  • (In Japanese)町田 幸子
  • (In Japanese)熊野 みゆき
  • (In Japanese)榊原 祥清
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title MOLECULE RECOGNIZING AGE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for readily preparing a mass of molecules binding with AGE (advanced glycation endproduct) in high specificity by recombining and expressing RAGE (AGE receptor) or a homologue thereof; and to provide a receptor chip for detecting the AGE for diagnosing diabetic vascular disorder, containing such the molecule, and a kit therefor.
SOLUTION: The biotinated RAGE prepared by recombination and expression by using a bacterial host cell and having a specific sequence and a homologue thereof are provided. The receptor chip is obtained by immobilizing the recombined and expressed biotinated RAGE and the homologue thereof on a solid phase.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年、糖尿病患者数は増加の一途を辿っている。それに伴い、糖尿病血管障害に罹患する患者人口も増加の一途を辿っいる。糖尿病患者の生活の質「QOL: Quality of Life」を損ねる元凶は血管合併症であり、全身の様々な組織傷害がそれによって起こるからである。これら全身での組織障害の中でも、眼、神経、および腎臓の障害は、それぞれ、糖尿病性網膜症、神経症、腎症(あわせて、三大合併症)とよばれ、特に、糖尿病において特徴的な疾患である。網膜症は、最終的には失明に至る疾患である。現在、後天性の失明原因の第1位が糖尿病によるものであり、日本においては年間約3000人の糖尿病患者が失明している。腎症は最終的には腎不全に至り、透析療法が必要となる、透析導入原疾患の第1位であり、年間約1000人が透析導入されている現状にある。現在では、このような合併症患者数が急激に増加し続けていることが、社会問題化しており、また、医学経済的にみても、これら合併症は、早期に解決すべき課題となっている。従って、これら合併症を早期に確実に検出する方法が求められている。



糖尿病状態で加速的に生成が亢進する物質としては、後期糖化反応生成物(AGE: Advanced Glycation End Product)が公知である。従って、AGEを高感度で検出する方法/キットを提供することによって、糖尿病血管障害の早期診断が可能となる。AGEの特異的受容体としては、RAGE(Receptor for AGE)が公知であり、AGE-RAGEの、糖尿病血管障害の発生・進展における役割が注目され、多くの研究が行われてきている。(例えば、非特許文献1)
しかしながら、RAGEを高発現する細胞は、後期の糖尿病患者の細胞でありそのため、天然の供給源は、限られている。AGEを検出する物質(センサー)としてRAGEを用いる場合には、RAGEを組換え発現する必要がある。



RAGEは糖鎖修飾された分子であり、AGE以外に、アンフォテリンにも結合することが公知である。レセプター分子の糖鎖修飾によって、そのレセプター分子の表面の形状が変化することから、一般的に、天然の状態で糖鎖修飾されているレセプターとリガンドとの結合には、レセプターの糖鎖部分が重要であると考えられている。RAGEとアンフォテリンとの結合の場合も、RAGEのN-グリカンが結合に重要であることが報告されている(例えば、非特許文献2)。そのため、RAGEの組換え発現には、真核生物宿主細胞を用いることが必須であると考えられていた。



その一方で、真核生物細胞を宿主として用いた場合には、原核生物細胞と比較して、操作がより煩雑であり、また、細胞の増殖に多大な費用および時間が必要とされるという欠点もある。



この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献1】
山本 靖彦、外4名、「AGE-RAGE系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性」、日薬理誌、日本薬理学会、2003年、121、49~56
【非特許文献2】
GeethaSrikrishna、外6名、N-Glycans on the receptor for advanced glycation end productsinfluence amphoterin binding and neurite outgrowth、Journal of Neurochemistry、InternationalSociety for Neurochemistry、2002、80、998-1008

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、AGEを認識する分子、ならびに、そのような分子の製造方法、および、そのようなキットを含むAGE検出のためのキットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、AGEと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下:
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;および、
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、該ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼによってビオチン化される、配列番号4に記載されるアミノ酸配列であり、
ここで、該ビオチン化配列は、該レセプター由来の配列のC末端側に連結され、
ここで、該ポリペプチドは、以下の工程:
(1’)該ポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含有する細菌宿主細胞を提供する工程;ならびに
(2’)該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細宿主細胞を培養する工程、
を包含する、方法によって製造される、ポリペプチド。

【請求項2】
 
前記レセプター由来の配列が配列番号2に記載されるアミノ酸配列である、請求項1に記載のポリペプチド。

【請求項3】
 
前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞であって、ここで、該ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が:
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項1に記載のポリペプチド。

【請求項4】
 
糖鎖修飾されていない、レセプター由来の配列およびビオチン化配列を含むポリペプチドを産生する方法であって、
該ポリペプチドは、AGEと結合し、ここで、該レセプター由来の配列は、以下:
(a)配列番号2に記載されるアミノ酸配列;および、
(b)配列番号2に記載されるアミノ酸配列に対して、1つの保存的置換を有するポリペプチドのアミノ酸配列;
からなる群から選択され、
ここで、該ビオチン化配列は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼによってビオチン化される、配列番号4に記載されるアミノ酸配列からなり、
ここで、該ビオチン化配列は、該レセプター由来の配列のC末端側に連結され、
ここで、該方法は、以下:
(1)該ポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;ならびに
(2)該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。

【請求項5】
 
前記ポリペプチドをコードする遺伝子がT7プロモーターと作動可能に連結している、請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
前記細菌宿主細胞が、ジスルフィド還元系に変異を有する細胞であって、ここで、該ジスルフィド還元系に変異を有する細胞が:
(i)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;
(ii)グルタチオンリダクターゼ遺伝子を欠損するE.coli;ならびに
(iii)チオレドキシンリダクターゼ遺伝子およびグルタチオンリダクターゼ遺伝子の両方を欠損するE.coli、
からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。

【請求項7】
 
前記細胞培養工程が15℃~37℃で行われる、請求項4に記載の方法。

【請求項8】
 
請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドが、ビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。

【請求項9】
 
表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチドがビオチンと特異的に結合し得る因子を介して固相に固定化された、受容体チップ。

【請求項10】
 
以下の工程を包含する、受容体チップの作製方法:
(1)請求項1~2のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、および、配列番号7に記載のアミノ酸配列からなるビオチンリガーゼをコードする遺伝子を含む細菌宿主細胞を提供する工程;
(2)該ポリペプチドおよび該ビオチンリガーゼが発現する条件下で、ビオチンを含む培地を用いて、該細胞を培養する工程;
(3)該培養した細胞から、該ポリペプチドを単離する工程、ならびに
(4)該単離したポリペプチドを、固相に固定化する工程
を包含する、方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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20867_01SUM.gif
State of application right Registered


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