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(In Japanese)遺伝子の発現を解析する方法

Patent code P08S000077
File No. NIRS-122J2
Posted date May 16, 2008
Application number P2002-550069
Patent number P4437171
Date of filing Dec 12, 2001
Date of registration Jan 15, 2010
International application number JP2001010898
International publication number WO2002048352
Date of international filing Dec 12, 2001
Date of international publication Jun 20, 2002
Priority data
  • P2000-377887 (Dec 12, 2000) JP
Inventor
  • (In Japanese)安倍 真澄
  • (In Japanese)齋藤 俊行
  • (In Japanese)服部 篤
  • (In Japanese)佐藤 伸司
  • (In Japanese)笠間 康次
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
  • (In Japanese)メッセンジャー・スケープ株式会社
  • (In Japanese)株式会社メイズ
Title (In Japanese)遺伝子の発現を解析する方法
Abstract (In Japanese)mRNAからcDNAを調製し、これを2つの制限酵素で切断し、得られた断片の一部分の配列を認識し、前記配列を基にプライマーセットで前記断片を分類し、同時に相対的発現量を反映したまま前記断片を増幅し、所定の分画に分類された夫々を分画毎に電気泳動し、その結果から遺伝子発現プロファイルを製作する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


西暦2000年、ヒトゲノムの全配列が決定されつつある。これにより得られた膨大なる情報は、全ての遺伝子および特定の細胞において発現されるそれらの遺伝子産物を含むネットワークを総括的に理解するための基礎となるであろう。
現在、そのようなネットワークを解明するための手段として使用される方法には以下のようなものがある。例えば、US5262311およびUS5599672に開示されるディファレンシャルディスプレー法、特表平10-511002に開示される遺伝子発現の逐次分析法(即ち、serial analysis of gene expression、以下SAGEと略す)、並びにUSP5807522、USP5700637およびUSP5744305に開示されるマイクロアレイおよびDNAチップ等である。
ディファレンシャルディスプレー法は、細胞から調製したcDNAを基質として用いる方法である。前記cDNAに対して、複数種類のアンカープライマーと任意のプライマーを用いてPCRを行うことにより、細胞における種々の任意の遺伝子発現が解析される。しかしながらこの方法は、全遺伝子のうちの一部分のみを分析できるに過ぎない。また、アンカープライマーと任意のプライマーを用いるため、再現性に乏しいことが問題である。
これに対して、細胞における全発現遺伝子について発現プロフィールを得ることを可能にした方法がSAGEである。SAGEでは、細胞から調製されたmRNAを用いて調製されたcDNAを用いて解析を行う。調製されたcDNAに対して制限酵素を処理し、9から11塩基対程度の断片を切り出し、得られた種々のcDNA由来の断片をライゲーションした後で、シーケンシングを行う。しかしながら、SAGEでは、全発現遺伝子の50%程度の種類についての情報を得るためには、約10万回のシーケンシングが必要であり、非常にコストが高いものである。また、cDNA由来の断片が短く、実際には、断片からの遺伝子単離が不可能なものも多い。
US5807522のマイクロアレイ、並びにUSP5700637およびUSP5744305のDNAチップは、固相に既知の遺伝子のプローブを固定したものである。当該プローブにサンプルをハイブリダイゼーションすることにより、遺伝子の発現プロフィールを得る方法である。これらの方法では、検出対象となる遺伝子はその配列が既知でなくてはならない。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、遺伝子の発現プロファイルを作製する方法、および遺伝子発現頻度を解析する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
(a)細胞から抽出されたmRNAに対して、その5’末端にタグ物質を付加されたcDNAを合成する工程と、
(b)得られた反応産物を第1の制限酵素Xによって切断する工程と、
(c)第1の制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるXアダプターを、工程bで得られた断片に対して結合させる工程と、
(d)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程cで得られた断片を回収する工程と、
(e)工程dで回収された断片を第2の制限酵素Yで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(f)工程eにおいて得られた断片に対して、第2の制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるYアダプターを付加する工程と、
(g)前記Xアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるXプライマーと、前記Yアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるYプライマーとを用いて、工程fで得られた断片についてPCR反応を行う工程と、
(h)得られたPCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することによって遺伝子発現プロファイルを作製する工程と、
を具備し、
前記制限酵素Xおよび前記制限酵素Yが、以下に示す酵素の群からそれぞれ選択されることを特徴とする方法;AspLEI、BfaI、BscFI、BsiSI、Bsp143I、CfoI、Csp6I、DpnII、HapII、HhaI、Hin2I、Hin6I、HinP1I、HpaII、Hsp92II、HspAI、Kzo9I、MaeI、MboI、MseI、MspI、NdeII、NlaIII、Sau3AI、Sse9I、TaqI、Tru1I、Tru9I、Tsp509I、TspEIおよびTthHB8I

【請求項2】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記Xプライマーが、更に、その5’末端に蛍光物質が付加されており、それによって、前記PCR産物の電気泳動の結果を前記蛍光物質の蛍光量を検出することにより行うことを特徴とする方法。

【請求項3】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記制限酵素XがMspIであり、且つ前記制限酵素YがMseIであることを特徴とする方法。

【請求項4】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記Xプライマーに含まれるNNとYプライマーに含まれるNNが、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンを組み合わせて設計され、且つ全部で256種類のXおよびYプライマーセットが使用されることを特徴とする方法。

【請求項5】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記タグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質の組合せが、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとアンタイDIG、プロテインAとマウスIgG、およびラテックス粒子からなる群より選択されることを特徴とする方法。

【請求項6】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
前記PCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程の後に、更に、
検出されたピークを回収してそこに含まれるPCR産物の配列をシーケンシングによって決定し、発現された遺伝子を同定する工程を具備する方法。

【請求項7】
 
請求項1に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
更に、前記制限酵素Xおよび制限酵素Yの認識配列と、工程aで得られた反応産物を制限酵素Xおよび制限酵素Yで切断して得られる断片の長さと、任意のデータバンクから入手したデータとを、コンピューター上で比較することによって、発現された遺伝子を同定する工程を具備する方法。

【請求項8】
 
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
(a)細胞から抽出されたmRNAに対して、その5’末端にタグ物質を付加されたcDNAを合成し、得られた合成産物を2つの分画に分ける工程と、
(b)第1の合成産物分画を第1の制限酵素Xによって切断する工程と、
(c)第1の制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるXアダプターを、工程bで得られた断片に対して結合させる工程と、
(d)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程cで得られた断片を回収する工程と、
(e)工程dで回収された断片を第2の制限酵素Yで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(f)工程eで得られた断片に対して、第2の制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるYアダプターを付加する工程と、
(g)前記Xアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるXプライマーと、前記Yアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるYプライマーとを用いて、前記工程fで得られた断片についてPCR反応を行う工程と、
(h)工程aで得られた第2の合成産物分画を前記制限酵素Yによって切断する工程と、
(i)前記制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な配列一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるY’アダプターを、工程hで得られた断片に対して結合させる工程と、
(j)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程iで得られた断片を回収する工程と、
(k)工程jで回収された断片を制限酵素Xで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(l)工程kで得られた断片に対して、前記制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるX’アダプターを付加する工程と、
(m)前記Y’アダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるY’プライマーと、前記X’アダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるX’プライマーとを用いて、PCR反応を行う工程と、
(n)工程gと工程mにおいて得られたPCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することによって発現プロファイルを作製する工程と、
を具備し、
前記制限酵素Xおよび前記制限酵素Yが、以下に示す酵素の群からそれぞれ選択されることを特徴とする方法;AspLEI、BfaI、BscFI、BsiSI、Bsp143I、CfoI、Csp6I、DpnII、HapII、HhaI、Hin2I、Hin6I、HinP1I、HpaII、Hsp92II、HspAI、Kzo9I、MaeI、MboI、MseI、MspI、NdeII、NlaIII、Sau3AI、Sse9I、TaqI、Tru1I、Tru9I、Tsp509I、TspEIおよびTthHB8I。

【請求項9】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、工程gにおいて使用される前記Xプライマーが、更に、その5’末端に蛍光物質が付加されており;および
工程mにおいて使用される前記Y’プライマーが、更に、その5’末端に蛍光物質が付加されており;
それによって、前記PCR産物の電気泳動の結果を該蛍光物質の蛍光量を検出することにより行うことを特徴とする方法。

【請求項10】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記制限酵素XがMspIであり、且つ前記制限酵素YがMseIであることを特徴とする方法。

【請求項11】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記Xプライマーに含まれるNNとYプライマーに含まれるNNが、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンを組み合わせて設計され、且つ全部で256種類のXおよびYプライマーセットが使用されることを特徴とする方法。

【請求項12】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、前記タグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質の組合せが、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとアンタイDIG、プロテインAとマウスIgG、およびラテックス粒子からなる群より選択されることを特徴とする方法。

【請求項13】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
前記PCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程の後に、更に、
検出されたピークを回収してそこに含まれるPCR産物の配列をシーケンシングによって決定し、発現された遺伝子を同定する工程を具備する方法。

【請求項14】
 
請求項8に記載の遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
更に、前記制限酵素Xおよび制限酵素Yの認識配列と、工程aで得られた反応産物を制限酵素Xおよび制限酵素Yで切断して得られる断片の長さと、任意のデータバンクから入手したデータとを、コンピューター上で比較することによって、発現された遺伝子を同定する工程を具備する方法。

【請求項15】
 
遺伝子発現頻度を解析する方法であって、
(1)コントロール細胞と被検細胞との両方について、以下の工程を行うことによって、遺伝子発現プロファイルを作製する工程と;
(a)細胞から抽出されたmRNAに対して、その5’末端にタグ物質を付加されたcDNAを合成する工程と、
(b)得られた反応産物を第1の制限酵素Xによって切断する工程と、
(c)第1の制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるXアダプターを、工程bで得られた断片に対して結合させる工程と、
(d)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程cで得られた断片を回収する工程と、
(e)工程dで回収された断片を第2の制限酵素Yで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(f)工程eにおいて得られた断片に対して、第2の制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるYアダプターを付加する工程と、
(g)前記Xアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるXプライマーと、前記Yアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端に任意の2塩基配列とからなるYプライマーとを用いて、工程fで得られた断片についてPCR反応を行う工程と、
(h)得られたPCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することによって遺伝子発現プロファイルを作製する工程と;並びに
(2)前記工程(1)により得られた2つの遺伝子発現プロファイルを比較することにより被検細胞の遺伝子発現頻度の変化を解析する工程と
を具備し、
前記制限酵素Xおよび前記制限酵素Yが、以下に示す酵素の群からそれぞれ選択されることを特徴とする方法;AspLEI、BfaI、BscFI、BsiSI、Bsp143I、CfoI、Csp6I、DpnII、HapII、HhaI、Hin2I、Hin6I、HinP1I、HpaII、Hsp92II、HspAI、Kzo9I、MaeI、MboI、MseI、MspI、NdeII、NlaIII、Sau3AI、Sse9I、TaqI、Tru1I、Tru9I、Tsp509I、TspEIおよびTthHB8I。

【請求項16】
 
遺伝子発現頻度を解析する方法であって、
(1)コントロール細胞と被検細胞との両方について、以下の工程を行うことによって、遺伝子発現プロファイルを作製する工程と;
(a)細胞から抽出されたmRNAに対して、その5’末端にタグ物質を付加されたcDNAを合成し、得られた合成産物を2つの分画に分ける工程と、
(b)第1の合成産物分画を第1の制限酵素Xによって切断する工程と、
(c)第1の制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるXアダプターを、工程bで得られた断片に対して結合させる工程と、
(d)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程cで得られた断片を回収する工程と、
(e)工程dで回収された断片を第2の制限酵素Yで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(f)工程eで得られた断片に対して、第2の制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるYアダプターを付加する工程と、
(g)前記Xアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるXプライマーと、前記Yアダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるYプライマーとを用いて、前記工程fで得られた断片についてPCR反応を行う工程と、
(h)工程aで得られた第2の合成産物分画を前記制限酵素Yによって切断する工程と、
(i)前記制限酵素Yの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるY’アダプターを、工程hで得られた断片に対して結合させる工程と、
(j)前記タグ物質に高親和性を有する物質に結合することにより、工程iで得られた断片を回収する工程と、
(k)工程jで回収された断片を制限酵素Xで切断し、前記タグ物質に結合した断片を取り除くことにより、切断されたcDNAの5’側を含む断片を得る工程と、
(l)工程kで得られた断片に対して、前記制限酵素Xの認識切断部位の配列に相補的な一本鎖配列と、それに隣接するPCRプライマーがアニールできる長さの二本鎖配列とからなるX’アダプターを付加する工程と、
(m)前記Y’アダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるY’プライマーと、前記X’アダプターの配列に相補的な配列とその3’末端の任意の2塩基配列であるNNとからなるX’プライマーとを用いて、PCR反応を行う工程と、
(n)工程gと工程mにおいて得られたPCR産物を電気泳動し、移動距離とピークを検出することによって発現プロファイルを作製する工程と;並びに
(2)前記工程1により得られた2つの遺伝子発現プロファイルを比較することにより被検細胞の遺伝子発現頻度の変化を解析する工程と
を具備し、
前記制限酵素Xおよび前記制限酵素Yが、以下に示す酵素の群からそれぞれ選択されることを特徴とする方法;AspLEI、BfaI、BscFI、BsiSI、Bsp143I、CfoI、Csp6I、DpnII、HapII、HhaI、Hin2I、Hin6I、HinP1I、HpaII、Hsp92II、HspAI、Kzo9I、MaeI、MboI、MseI、MspI、NdeII、NlaIII、Sau3AI、Sse9I、TaqI、Tru1I、Tru9I、Tsp509I、TspEIおよびTthHB8I。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2002550069thum.jpg
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