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METHOD FOR SEPARATING HEAT SHOCK PROTEIN HSP60

Patent code P08A013418
Posted date May 30, 2008
Application number P2006-219450
Publication number P2008-043216A
Patent number P4929458
Date of filing Aug 11, 2006
Date of publication of application Feb 28, 2008
Date of registration Feb 24, 2012
Inventor
  • (In Japanese)又吉 盛健
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 鹿児島大学
Title METHOD FOR SEPARATING HEAT SHOCK PROTEIN HSP60
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and efficiently separating heat shock protein PSP60.
SOLUTION: The method for separating the heat shock protein HSP60 comprises stirring bacterial spheroplast in a 1.5 to 5% salt solution, preferably treating the bacterial spheroplast with a cell-wall digesting enzyme.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


従来、細菌を40~45℃の高温で培養すると、HSP60等の熱ショックタンパク質の発現が誘導されて菌体内に発現することが知られている(非特許文献1及び2)。また、熱ショックタンパク質は、細菌の他に、ヒトを含めた真核生物まで存在することが判っている(非特許文献3)。熱ショックタンパク質の真核生物の細胞内局在としては、例えば、ミトコンドリアやクロロプラストが挙げられる(非特許文献4~6)。また、熱ショックタンパク質は、タンパク質の折りたたみや変性タンパク質の修正に関与することが知られている(非特許文献7及び8)。



一方、これまで、例えばHSP60は、細菌でも細胞質内に存在すると考えられていた(非特許文献1、3及び9~11)。そこで、従来より、HSP60等の熱ショックタンパク質の抽出方法では、細胞壁や細胞膜を破砕することが不可欠な工程であった。細胞壁や細胞膜の破砕後、種々の煩雑な分別方法を用いて、熱ショックタンパク質を精製していた(非特許文献12及び13)。このような従来の熱ショックタンパク質の分離方法では、出発材料である細胞を破砕して得られる懸濁液には膜破片、リボソーム、核酸、細胞質内タンパク質が混在するため、熱ショックタンパク質のみを精製するには、多くの工程を必要とし、煩雑で、時間を費やし、また最終的な収量が少ないといった問題がある。



従って、これまでに効率的に熱ショックタンパク質を分離する方法が知られていなかった。



【非特許文献1】
Angelo Scorpioら, 「Journal of Bacteriology」, 1994年, 第176巻, p.6449-6456
【非特許文献2】
F. Goulhenら, 「Infection and Immunity」, 1998年, 第66巻, p.5307-5313
【非特許文献3】
Alejandro M. Vialeら, 「International Journal of Systematic Bacteriology」, 1994年, 第44巻, p.527-533
【非特許文献4】
McMullin T.W.ら, 「Molecular and Cellular Biology」, 1987年, 第7巻, p.4414-4423
【非特許文献5】
Jindal S.ら, 「Molecular and Cellular Biology」, 1989年, 第9巻, p.2279-2283
【非特許文献6】
Paul V. Viitanenら, 「The Journal of Biological Chemistry」, 1992年, 第267巻, p.695-698
【非特許文献7】
F. Ulrich Hartl, 「Nature」, 1996年, 第381巻, p.571-580
【非特許文献8】
Bernd Bukauら, 「Cell」, 1998年, 第92巻, p.351-366
【非特許文献9】
Gupta R.S.ら, 「Molecular Microbiology」, 1995年, 第15巻, p.1-11
【非特許文献10】
Rafael A. Gardunoら, 「Journal of Bacteriology」, 1998年, 第180巻, p.505-513
【非特許文献11】
Claire Hennequinら, 「Microbiology」, 2001年, 第147巻, p.87-96
【非特許文献12】
Zahn R.ら, 「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America」, 1996年, 第93巻, p.15024-15029
【非特許文献13】
Gabriela E. Bergonzelliら, 「Infection and Immunity」, 2006年, 第74巻, p.425-434

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、例えば、細菌のペリプラズムに存在する熱ショックタンパク質HSP60(以下、「HSP60」という)の分離方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(a) 細菌のスフェロプラストを1.5%~5%の塩溶液中で撹拌処理することで、溶液中に熱ショックタンパク質HSP60を遊離する工程と、
(b) 工程(a)で得られた溶液を固液分離手段に供することで、液相中に熱ショックタンパク質HSP60を分離する工程と、
(c) 工程(b)で得られた液相をタンパク質精製手段に供し、該液相から熱ショックタンパク質HSP60を分離精製する工程と、
を含む、ペリプラズム局在熱ショックタンパク質HSP60の分離方法。

【請求項2】
 
上記スフェロプラストが、細菌を細胞壁分解酵素で処理することによって得られるものであることを特徴する、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
工程(a)の前に、細菌を細胞壁分解酵素で処理することで、スフェロプラストを形成する工程を含む、請求項1記載の方法。

【請求項4】
 
上記細胞壁分解酵素がリゾチームであることを特徴とする、請求項2又は3記載の方法。

【請求項5】
 
上記固液分離手段が、遠心分離、濾過及び吸着から成る群から選択されるものであることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。

【請求項6】
 
工程(c)が、工程(b)で得られた液相を10000~40000rpmでの遠心分離に供することを含む、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。

【請求項7】
 
上記細菌が大腸菌であることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項記載の方法。

【請求項8】
 
40℃~45℃の温度下で培養した細菌を使用することを特徴とする、請求項1~7のいずれか1項記載の方法。

【請求項9】
 
上記塩溶液が塩化ナトリウム溶液であることを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
(In Japanese)公開特許は弊社ホームページ内で開示資料とともに、特許公報も掲載しております。
アドレスは http://www.ktlo.co.jp/002_seeds_.html


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