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NEW P450 GENE AND PRODUCTION OF USEFUL ISOQUINOLINE ALKALOID USING THE SAME

Patent code P08A013537
File No. 1407
Posted date Jul 4, 2008
Application number P2006-238805
Publication number P2008-054644A
Patent number P5098008
Date of filing Sep 4, 2006
Date of publication of application Mar 13, 2008
Date of registration Oct 5, 2012
Inventor
  • (In Japanese)佐藤 文彦
  • (In Japanese)池澤 信博
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人京都大学
Title NEW P450 GENE AND PRODUCTION OF USEFUL ISOQUINOLINE ALKALOID USING THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new P450 enzyme related to biosynthesis of isoquinoline alkaloid and to provide a method for producing corytuberine by treating the enzyme with a catalyst.
SOLUTION: The gene comprises a polynucleotide composed of a specific base sequence derived from Coptis japonica. The protein comprises a specific amino acid sequence and has P450 enzyme activity of catalyzing a carbon-carbon coupling reaction. The method for producing corytuberine comprises converting reticulin being a substrate into corytuberine by treatment of the protein as a catalyst.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


シトクロームP450(本明細書および特許請求の範囲において、P450と称する)は、細菌から高等生物に至るまで広く存在するヘムタンパク質であり、その反応は多岐にわたる。高等植物は、極めて多様な化学構造や生理活性を有する二次代謝産物を生産する。二次代謝産物は、医薬品、着色料、芳香料として用いられている。植物における二次代謝産物の生合成には、多くのP450が関与していることが示されている。



例えば、P450は、内在性基質および生体異物基質の酸化的、過酸化的、および還元的代謝を含む多様な範囲の化学的に異なる基質の酵素反応を触媒する。植物では、P450は、フェニルプロパノイド、アルカロイド、テルペノイド、脂質、シアン発生性配糖体、グルコシノラートのような、植物生成物の合成を含む生化学的経路に関与する(非特許文献1)。P450に触媒される特異的反応には、脱メチル化、水酸化、エポキシ化、N-酸化、スルホオキシデーション;N-、S-、およびO-脱アルキル化、脱硫酸化、脱アミノ化、ならびにアゾ、ニトロ、およびN-オキシド群の還元が知られている。



薬用植物であるオウレンは、抗菌性アルカロイドであるベルベリン等、主に7種類のイソキノリンアルカロイドを生産する。これら7種の産物は、イソキノリンアルカロイド生合成系において重要な中間産物であるレチクリンを経由して生合成されると考えられる。



イソキノリンアルカロイド生合成系に特異的なP450としては、メギ科植物から単離された、炭素-酸素カップリングを触媒するCYP80A1、ケシ科ハナビシソウから単離された、水酸化反応を触媒するCYP80B1、キンポウゲ科オウレンから単離された、メチレンジオキシ環形成を触媒するCYP719A1等が知られている(図1参照)。しかし、炭素-炭素カップリング反応を触媒するP450は未だに知られていない。



P450酵素の多様性、即ちその異なる構造および機能により、P450酵素についての研究は非常に困難なものであった。さらに、P450酵素のクローニングは、これらの膜局在化タンパク質は通常低量で存在し、精製するにはしばしば不安定であるため、少なくとも部分的に阻止されてきた。



一方、イソキノリンアルカロイドのひとつであるマグノフロリンは、ホウノキやオウレンなどに含まれるイソキノリンアルカロイドであり、薬効性があることが知られているが、その生産は天然物からの抽出に依存しており、利用は生薬などに限定されている(特許文献1)。
【特許文献1】
特開平6-183983号公報
【非特許文献1】
Chapple, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998, 49: 311-343

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、イソキノリンアルカロイド生合成系に存在する炭素-炭素カップリング反応を触媒するP450、該P450をコードする遺伝子、および該P450を用いた有用イソキノリンアルカロイドの生産に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項2】
 
配列番号1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、レチクリンからコリツベリンへの変換反応を触媒するP450酵素をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子。

【請求項3】
 
オウレン由来である請求項1または2のいずれかの遺伝子。

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。

【請求項5】
 
請求項1~3のいずれかの遺伝子または請求項4の組換えベクターを含む宿主細胞。

【請求項6】
 
酵母ならびに、ケシ科植物、キンポウゲ科植物、メギ科植物、ツヅラフジ科植物、ミカン科植物、モクレン科植物からなる群から選択される請求項5の宿主細胞。

【請求項7】
 
以下の(a)または(b)のタンパク質:
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、レチクリンからコリツベリンへの変換反応を触媒するP450酵素の活性を有するタンパク質。

【請求項8】
 
請求項5または6の宿主細胞を培養する工程、および、
該宿主細胞において請求項7のタンパク質を発現させる工程、
を含む、請求項7のタンパク質の産生方法。

【請求項9】
 
請求項7のタンパク質を触媒として作用させ、基質であるレチクリンをコリツベリンに変換する工程を含む、コリツベリンの産生方法。

【請求項10】
 
請求項7のタンパク質を触媒として作用させ、基質であるレチクリンをコリツベリンに変換する工程、および、
コクラウリン-N-メチルトランスフェラーゼを触媒として作用させ、基質であるコリツベリンをマグノフロリンに変換する工程、
を含む、マグノフロリンの産生方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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