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METHOD FOR DETECTING COMPOUND INTERACTING WITH MOLECULE ON CELL MEMBRANE commons meetings achieved foreign

Patent code P08A013735
File No. 505-563
Posted date Sep 26, 2008
Application number P2007-017667
Publication number P2008-182917A
Patent number P4929462
Date of filing Jan 29, 2007
Date of publication of application Aug 14, 2008
Date of registration Feb 24, 2012
Inventor
  • (In Japanese)本家 孝一
  • (In Japanese)小谷 典弘
  • (In Japanese)谷口 直之
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人高知大学
  • (In Japanese)国立大学法人大阪大学
Title METHOD FOR DETECTING COMPOUND INTERACTING WITH MOLECULE ON CELL MEMBRANE commons meetings achieved foreign
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple and inexpensive method by which a live cell can directly be used without separating a cell membrane etc., from a cell and a compound interacting with a molecule on the cell membrane to be a target can widely be detected and to provide a kit for carrying out the method.
SOLUTION: The method for detecting the compound interacting with the molecule on the cell membrane comprises the following steps: a step of reacting a compound having a selective binding part to the molecule on the cell membrane and a radicalization promoting part with the cell; a step of further reacting a compound having a group radicalized with the radicalization promoting part and a labeling group with the cell; and a step of specifying a compound in which the compound radicalized with the radicalization promoting part is bound.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


細胞膜を構成するリン脂質二重層中には、多数のタンパク質やリン脂質以外の脂質などが存在しており、増殖因子受容体や細胞接着因子、イオンチャネル等として機能しているものがある。これら細胞膜上分子は、細胞膜内を比較的自由に移動することができ、集合や解離を繰り返している。特に、細胞膜上分子が複数集合し、細胞膜表面に露出したラフトと呼ばれるものは、細菌やウィルスなどの受容体や、細胞外情報が細胞内に伝達される際のプラットフォームになるなど、重要な役割を担う。よって、ある細胞膜上分子が、他のいかなる細胞膜上分子と協働して機能するかを知ることは、生化学的研究において極めて重要である。



ところが、細胞膜上分子間の相互作用の解析は、非常に難しい。例えば、ある標的タンパク質と相互作用するタンパク質を分離検出する方法として、標的タンパク質に特異的な抗体を作用させて選択的に沈殿させる免疫沈降法が知られている。しかし、この方法では、標的タンパク質と他のタンパク質が生理条件下で相互作用した状態を反映させるのは困難である。何故ならこの方法では、細胞膜上で標的タンパク質に他のタンパク質が相互作用している場合であっても、細胞膜から標的タンパク質を分離した段階でかかる相互作用が解消される可能性があるためである。また、生細胞の細胞膜上では相互作用していないにも関わらず、タンパク質の分離段階で擬性の相互作用が生じる場合もある。



他には、標的タンパク質にクロスリンカーを結合し、相互作用するタンパク質と架橋させて特定するクロスリンカー法が知られている。しかし、当該方法では、クロスリンカー分子の長さと形状が固定されるため、架橋され検出されるのは一部の密着したタンパク質のみとなる。その結果、このクロスリンカー法による細胞膜上分子間の相互作用の解析では、成功例が少ない。



従って、上記以外の方法で、細胞膜上分子間の相互作用を検出することに特化した技術が検討されている。



例えば、特許文献1には、細胞膜上に存在するABC(ATP Binding Cassette)タンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法が記載されている。当該方法は、ABCタンパク質が発現している膜画分、標識されたヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸不動化物質、および被検物質を接触させるものである。



また、特許文献2には、細胞に膜貫通型タンパク質を発現させ、さらに候補化合物を接触させて、候補化合物を接触させなかった場合との膜貫通型タンパク質の分布の変化を検出することにより、膜貫通型タンパク質と相互作用する候補化合物をスクリーニングする方法が記載されている。
【特許文献1】
特開2005-24245号公報
【特許文献2】
特表2005-522227号公報

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、細胞膜上分子と相互作用する化合物を検出する方法と、当該方法を実施するためのキットに関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞膜上分子と相互作用する化合物を検出する方法であって、
標的細胞膜上分子への選択的結合部分とラジカル化促進部分であるペルオキシダーゼまたはヘム化合物とを有する化合物を、細胞に作用させる工程;
上記ラジカル化促進部分によりラジカル化される、水酸基、アジド基、ハロゲン基、およびインドール基からなる群から選択される1または2以上の基と標識基とを有する化合物を、さらに細胞に作用させる工程;
上記ラジカル化促進部分によりラジカル化された化合物が結合した化合物を特定する工程;
を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】
 
標識基として、ビオチン、蛍光発色基、放射性同位元素含有基、標識ペプチド、またはハプテンを用いる請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
ラジカル化化合物が結合した細胞膜上分子の特定を、ウェスタンブロット、抗体アレイ、マススペクトロメトリー、免疫沈降法、または免疫組織染色により行う請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
ラジカル化される基と標識基が、アルキレン基、エーテル基、チオエーテル基、アミド基、またはこれら2以上の基の組み合わせからなるリンカー基で結合されている請求項1~3の何れか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
請求項1~4の何れか1項に記載の方法を実施するためのキットであって、
標的細胞膜上分子への選択的結合部分とラジカル化促進部分であるペルオキシダーゼまたはヘム化合物とを有する化合物、
上記ラジカル化促進部分によりラジカル化される、水酸基、アジド基、ハロゲン基、およびインドール基からなる群から選択される1または2以上の基と標識基とを有する化合物、
上記ラジカル化促進部分によりラジカル化された化合物が結合した化合物の特定手段、
を含むキット。

【請求項6】
 
標識基が、ビオチン、蛍光発色基、放射性同位元素含有基、標識ペプチド、またはハプテンである請求項5に記載のキット。

【請求項7】
 
ラジカル化促進部分によりラジカル化された化合物が結合した化合物の特定手段が、ウェスタンブロット、抗体アレイ、マススペクトロメトリー、免疫沈降法、または免疫組織染色を行うためのものである請求項5または6に記載のキット。

【請求項8】
 
ラジカル化される基と標識基が、アルキレン基、エーテル基、チオエーテル基、アミド基、またはこれら2以上の基の組み合わせからなるリンカー基で結合されている請求項5~7の何れか1項に記載のキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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21743_01SUM.gif
State of application right Registered
Shikoku TLO is introducing the seeds of 4 inside 20 university and a technical college. Please ask to the following about the detailed contents of seeds. I am waiting for an inquiry.


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