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(In Japanese)細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液

Patent code P08S000126
Posted date Nov 27, 2008
Application number P2007-512410
Patent number P4724836
Date of filing Jan 19, 2006
Date of registration Apr 22, 2011
International application number JP2006300698
International publication number WO2006109367
Date of international filing Jan 19, 2006
Date of international publication Oct 19, 2006
Priority data
  • P2005-108157 (Apr 5, 2005) JP
Inventor
  • (In Japanese)石井 利明
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人帯広畜産大学
Title (In Japanese)細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液
Abstract (In Japanese)
【課題】
 接着性動物細胞を浮遊状態で正常に培養増殖させ、この培養増殖させた接着性動物細胞を所望の場所に再び定着させる方法を提供する。
【解決手段】
 本発明に係る細胞遊離法は、細胞を培養している培養器の培養液中にラクトフェリン(Lactoferrin)を加えることを特徴とするものである。また、本発明に係る細胞培養法は、ラクトフェリンを含む培養液中で細胞を浮遊培養することを特徴とするものである。また、本発明に係る細胞定着法は、ラクトフェリンを希釈するか、ラミニンを被覆した培養器に浮遊細胞を含む培養液を移すか、グリコサミノグリカンを添加することを特徴とするものである。これらにおいて、前記細胞は接着性動物細胞であり、前記培養液中には血清が含まれている。
【選択図】
 図1
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


最近の医療技術や検査技術の進歩は著しく、新たな医療技術や新たな検査技術が次々と開発されてきている。新たな医療技術や新たな検査技術の開発では、細胞を用いた種々の実験・研究が行われている。



細胞を用いた種々の実験・研究では、その目的に応じて必要な細胞数や培養皿枚数を用意する必要があるので、無処置の細胞(マスター細胞)を絶えず継代的に培養し続けなければならない。



継代的に培養し続けたマスター細胞は、必要に応じて、培養皿から剥離後懸濁させ、一部は継代培養のために再度マスター細胞用の培養皿へ、また細胞懸濁液の残りは、実験・研究用に必要な細胞数を実験施行時までに満たすべく、増殖速度を計算しながら、それに適した大きさの、必要な枚数だけ、培養皿上に撒き、増殖させている。



マスター細胞を継代的に培養せず、毎回、液体窒素内で冷凍保存している細胞を起こして使用することも不可能ではないが、細胞を起こして実験に使えるように準備するのには時間がかかり過ぎるので、通常は上述したような継代的な培養方法が採られる。



目的の細胞数にまで増殖させた細胞は、その実験・研究の内容に合わせて利用する。ここで、増殖させた細胞は、培養皿上に接着させたまま利用する場合と、培養皿から剥離させて利用する場合がある。



培養皿から剥離させて利用する場合は、培養皿から細胞を剥離させなければならないが、培養皿から細胞を剥離させる方法としては、一般に、培養液中にトリプシンなどのタンパク質分解酵素を添加し、培養細胞の培養皿との結合部を溶かすことにより細胞を剥離させる方法が使用されている。そして、この方法において、剥離させる細胞に培養液の液流を吹き付けてフラッシングすることにより細胞を剥離させる方法も併せて採られることも有る。



しかし、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用したり、培養液の液流を吹き付けてフラッシングをすると、培養細胞が損傷を受け、その機能回復に時間を要するという問題が有る。



また、種々の事情から、培養細胞を別の場所に輸送しなければならない場合が有る。培養細胞は培養器の内面から剥離すると死んでしまうので、輸送中に、細胞を培養したフラスコ内の培養液が揺れて培養細胞が剥離しないように、このフラスコに更に培養液を満たして培養液が揺れないようにしている。



しかし、このような対策を採っても、迅速に、しかも振動などの衝撃を加えないように注意して運搬しなければならないので、培養細胞の輸送は非常に面倒である。
【特許文献1】
特開2004-75547号公報
【特許文献2】
特開平8-66184号公報

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ラクトフェリンを用いた細胞遊離法、細胞遊離液、細胞培養法、細胞培養液、細胞液、細胞液製剤、細胞定着法及び細胞定着液に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞培養液中において接着性動物細胞を担体の表面に接着させた状態で培養し、その後ラクトフェリンを含む細胞遊離液と該細胞培養液とを混合して該担体から該接着性動物細胞を遊離させる細胞遊離法であって、該接着性動物細胞は神経細胞又は神経幹細胞であり、該細胞培養液は血清を5~20%の濃度範囲で含み、該細胞遊離液は該細胞培養液と混合した時のラクトフェリンの濃度が10~500μMとなる濃度でラクトフェリンを含んでいることを特徴とする細胞遊離法。

【請求項2】
 
前記細胞遊離液のラクトフェリンを除いた成分が前記細胞培養液の成分と略同一であることを特徴とする請求項1に記載の細胞遊離法。

【請求項3】
 
血清を5~20%、ラクトフェリンを1~10mM含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞遊離液。

【請求項4】
 
血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含む細胞培養液中で神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を浮遊状態で培養することを特徴とする細胞培養法。

【請求項5】
 
血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含むことを特徴とする細胞培養液。

【請求項6】
 
血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含み、神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を浮遊状態で含む細胞培養液からなることを特徴とする細胞液。

【請求項7】
 
注射筒と、該注射筒内に充填された細胞液とからなり、該細胞液は、血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含み、更に神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を浮遊状態で含むことを特徴とする細胞液製剤。

【請求項8】
 
浮遊状態の神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞及びラクトフェリンを含む細胞液を定着予定部に入れ、その後該定着予定部にラクトフェリンを含まない細胞培養液を加えて該細胞液中のラクトフェリンの濃度を減じ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該細胞液が血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含むことを特徴とする細胞定着法。

【請求項9】
 
ラクトフェリンを含まない培養液で濃度を減じられた前記細胞液中のラクトフェリンの濃度が10μM未満であることを特徴とする請求項8に記載の細胞定着法。

【請求項10】
 
定着予定部に浮遊状態の神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を含む細胞液を入れ、その後該定着予定部の細胞液に該接着性動物細胞の浮遊効果を失効させる失効物質を加えて、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該失効物質がグリコサミノグリカンであり、該細胞液が血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含むことを特徴とする細胞定着法。

【請求項11】
 
浮遊状態の神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を定着させる際の前記細胞液中のグリコサミノグリカンの濃度が10~500μg/mlであることを特徴とする請求項10に記載の細胞定着法。

【請求項12】
 
定着予定部に神経細胞又は神経幹細胞である接着性動物細胞を定着させる定着物質を被覆し、その後浮遊状態の該接着性動物細胞を含む細胞液を該定着予定部に入れ、該定着予定部に該接着性動物細胞を定着させる細胞定着法であって、該定着物質が細胞外マトリックスタンパク質であり、該細胞液が少なくとも血清を5~20%、ラクトフェリンを10~500μM含むことを特徴とする細胞定着法。

【請求項13】
 
前記細胞外マトリックスタンパク質がラミニンであることを特徴とする請求項12に記載の細胞定着法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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State of application right Registered
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