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核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法 コモンズ

国内特許コード P08S000139
整理番号 A161P11
掲載日 2009年2月27日
出願番号 特願2002-572395
登録番号 特許第3956214号
出願日 平成13年3月13日(2001.3.13)
登録日 平成19年5月18日(2007.5.18)
国際出願番号 JP2001001974
国際公開番号 WO2002073183
国際出願日 平成13年3月13日(2001.3.13)
国際公開日 平成14年9月19日(2002.9.19)
発明者
  • 梅澤 喜夫
  • 青木 寛
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法 コモンズ
発明の概要 任意の配列を有する核酸を特異的に検出できる簡便で汎用性の高い方法として、電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定する。
従来技術、競合技術の概要


近年、分子生物学分野における技術的発展により、様々な生物のゲノム構造が明らかになりつつある。また、ゲノム構造の解明により、様々な遺伝的疾患やウィルス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らかになっている。そのため、医学、法医学、分子生物学等の様々な分野において、特定遺伝子配列や遺伝子配列の変異を検出、解析する方法の確立が重要な課題となっている。
これまで、分光学的、生物化学的、あるいは電気化学的に遺伝子変異を検出、解析する方法が研究されている。現在のところ、一般的には、電気泳動法や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法が遺伝子変異の検出、解析に用いられているが、これらの従来法は、いずれも多くのサンプルを同時に解析することが困難である、解析に長時間を要する上、精度が高くないなどの問題があった。
近年になって、高い測定精度を有し、微量の試料で検出が可能で、多検体を同時に分析することが可能な電気化学的測定法が注目され、様々な修飾電極がバイオセンサーとして研究、報告されている(Wang,J.,Anal.Chem.1999,71,328)。
具体的には、電極表面に膜状に酵素を固定化し、酵素反応により物質変化を電気信号に変換し、検出する酵素電極が初期に報告された。しかし、これを遺伝子の検出や解析に用いるためには、分析物(標的遺伝子)と特異的に反応する酵素を選択しなければならず、汎用性が低いという問題が残った。
そこで、最近では、電極上に固定化されたプローブと標的遺伝子のハイブリダイゼーションを電気信号として検出するDNAバイオセンサーに関する研究が盛んに行われている。例えば、Patolskyらは金電極上にホスホチオレート基を介してビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを固定化し、プローブとターゲットDNA単鎖を接触させることによりハイブリッドを形成させ、さらにビオチンと特異的に相互作用するアビジンを結合した酵素を反応させてその酵素反応に基づく電気信号からDNAを検出する方法を報告している(Langmuir,1999,15,3703)。しかし、このような方法は、プローブの固定化、ハイブリダイゼーション、タンパク質相互作用、酵素反応、生成物の電極上への析出という多くの操作を必要とし、簡便とは言い難かった。
また、Takenakaらは、金電極上にチオールアンカーを介して化学吸着させたオリゴヌクレオチドプローブを用いてナフタレン-フェロセン酸化還元インターカレーターによってDNAを検出する方法を報告している(Anal.Chem.2000,72,1334)。しかし、インターカレーターを電極活性プローブとして用いる方法では、一般的に単鎖DNAと二重鎖DNAの識別は可能なものの、インターカレーターの結合領域の配列依存性があるため、分析物に対応したインターカレーターを選択する必要があるという問題があった。
さらに、De Lumley-Woodyearらはガラス状カーボン電極上に導電性酸化還元高分子膜を形成し、酵素(HRP)でラベルした(dT)25-30または(dA)25-30を共有結合させ、相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって起こる酵素反応に基づく電気信号を検出する方法を報告している(Anal.Chem.1999,71,394)。しかし、このような酵素ラベルを用いる方法では、オリゴヌクレオチドを酵素でラベルする際に煩雑な操作を必要とする上、過剰なラベル酵素を洗浄除去する必要があり、測定精度が必ずしも安定しないという問題があった。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、任意の配列を有する核酸を特異的に検出できる簡便で汎用性の高い方法を提供することを課題としている。

産業上の利用分野


この出願の発明は、核酸塩基対の相補性を電気化学的に検出する方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、分析物核酸の配列を、電極に結合したプローブ核酸との塩基対相補性を電気化学的に検出することにより確認する方法に関するものである。

特許請求の範囲 【請求項1】 電極に少なくとも核酸単鎖を結合して得られる修飾電極を、分析物核酸単鎖と酸化還元マーカーを含有する溶液に接触させ、酸化還元マーカーの酸化還元反応を測定することを特徴とする核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項2】 電極は、金ディスク電極である請求項1の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項3】 修飾電極には核酸単鎖とともに、分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子を結合する請求項1または2のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項4】 核酸単鎖および分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子は、電極表面に混合単分子膜を形成している請求項3の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項5】 分析物核酸単鎖と相補性を有さない分子が6-メルカプト-1-ヘキサノールである請求項3または4のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項6】 核酸単鎖がペプチド核酸単鎖である請求項1ないし5のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項7】 分析物核酸単鎖の濃度が10-11~10-2Mである請求項1ないし6のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項8】 分析物核酸単鎖がDNA単鎖である請求項1ないし7のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項9】 酸化還元マーカーが〔Fe(CN)64-/3-である請求項1ないし8のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項10】 〔Fe(CN)64-/3-の濃度が0.1~1mMである請求項9の核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
【請求項11】 酸化還元反応は、ボルタンメトリーにより測定する請求項1ないし10のいずれかの核酸塩基対相補性の電気化学的検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2002572395thum.jpg
出願権利状態 登録
参考情報 (研究プロジェクト等) CREST 内分泌かく乱物質 領域
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