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(In Japanese)抗ヒトCENP-Aペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の作成、及びその利用法 achieved

Patent code P08S000143
File No. A021P48
Posted date Feb 27, 2009
Application number P2003-564094
Patent number P4155464
Date of filing Jul 4, 2002
Date of registration Jul 18, 2008
International application number JP2002006773
International publication number WO2003064474
Date of international filing Jul 4, 2002
Date of international publication Aug 7, 2003
Priority data
  • P2002-023587 (Jan 31, 2002) JP
Inventor
  • (In Japanese)依田 欣哉
  • (In Japanese)野崎 直仁
  • (In Japanese)岡崎 恒子
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)抗ヒトCENP-Aペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の作成、及びその利用法 achieved
Abstract (In Japanese)本発明は、染色体のセントロメアに発現する蛋白質CENP-AのN末端の1/3のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とする抗体、特にモノクローナル抗体、及びその製造方法を提供する。
染色体のセントロメアに発現するCENP-A蛋白質の部分長のペプチド、好ましくはCENP-A蛋白質の3~19番目のアミノ酸配列を含むペプチド、27~40番目のアミノ酸配列を含むペプチド、又は126~140番目のアミノ酸配列を含むペプチドに対する抗体、及びその製造方法に関する。
さらに本発明は、0.3M NaCl、MNase処理によりセントロメアクロマチンの完全性を保存した形で可溶化する方法を提供する。抗CENP-A抗体を担体に化学結合し、免疫沈降法によって、単離精製する抗CENP-A抗体の利用法を提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


セントロメアは、有糸分裂をする真核細胞のM期の紡錘体に結合して、極への移動に重要な役割を果たすものである。有糸分裂においては、セントロメアの両端に動原体と呼ばれるタンパク質複合体が形成され、この動原体に紡錘体を形成する微小管(動原体微小管)が結合する。脊椎動物の細胞における有糸分裂において、動原体で形成され紡錘体の微小管への付着部位であるキネトコアは、密な内部プレート、中間の透明な領域、そして密な外部プレートから成る3層の円盤状の構造体である。
今日までに知られている動原体タンパクには、細胞周期を通して動原体に存在するCENP-A、-B、-Cおよび-Hのような構成的タンパク、ならびにCENP-E、-F、INCENP、Mad1、Mad2、Bub1、Bub2およびRubR1のようなM期の開始後に現われる過渡的タンパクが含まれる。構成的タンパクは、「プレキネトコア」と呼ばれるS期で核の中に点として現われるが、これはそのうちの少なくとも1つがM-期で内部キネトコアプレートの中に位置していると報告されているからである。
CENP-B遺伝子は、ヒトのα-サテライトおよびマウスのマイナーサテライトDNA中に存在しCENP-Bボックスとして知られている17-bpDNAモチーフと結合する80-kDaタンパクをコードし、CENP-Bボックス領域の周辺に位置するヌクレオソームのポジショニング(塩基配列上の決まった位置に整列すること)をもたらす。この遺伝子のノックアウトマウスは、成長および形態的に如何なる明白な欠陥なしに生育するので、CENP-B遺伝子は必須のものではないと考えられている。
CENP-C遺伝子は染色体分離に必須であり、その遺伝子生産物(140-kDaタンパク)は明らかな配列特異性のないDNA-結合タンパクである。CENP-Cは電子顕微鏡により内部のキネトコアプレートで検出され、一方CENP-Bは対を成す領域中に位置すると報告された。
CENP-A遺伝子はヒストンH3の変種をコードしており、CENP-AのC末端の2/3はヒストンH3と高度に相同であるが、1/3のそれ以外のアミノ端末はCENP-Aに固有のものである。C-末端領域に位置するヒストン類似配列から成る領域は、CENP-Aを動原体領域へ標的とするために必須のものである。マウスのCENP-A遺伝子は、ジーンターゲッティング法により必須の遺伝子であることが示されている。CENP-AホモログであるCSE4は、出芽酔母(S.cerevisiae)から単離され、そして染色体の分離のために必須であることもまた示された。点変異による分析により、Cse4pの機能的な領域は、ヒストンH4との相互作用に必要なヒストンフォルドドメインならびにアミノ末端33ペプチドにわたって分布していることが示された。CENP-Aのホモログは線虫(C.elegans)、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)、および分裂酵母(S.pombe)中で同定されており、また染色体分離のためにも必須である。
出芽酵母(S.cerevisiae)においてセントロメア領域は、“CEN配列”として知られている125bp DNA配列が遺伝的に定義され、Cse4pを含めて8以上の動原体と関連するタンパクがこのDNA領域に局在し、ヌクレアーゼ攻撃に抵抗性のある高次のクロマチン複合体を形成する。分裂酵母(S.pombe)においては、数十キロ塩基の逆方向反覆配列に囲まれた4-7kbの固有の配列(cc領域)から成る更に長いDNA配列(40-120kb)が、セントロメア領域を形成する。何らかの高次クロマチン構造がcc領域内で形成されるであろう事が推測される。何故ならばこの領域内ではMNase開裂によるヌクレオソームラダー(ladder)は活性セントロメアを形成したときにスミアー(smear)となるからである。高等真核生物の動原体は、数百から数千キロベースの縦に反覆されたDNA配列を含んでいる。ただし、それらの配列と単位長さは種によって全く異なる(52)。
ヒトにおいては、500kbから5Mbまで変化するα-サテライト(アルフォイド)配列がセントロメア領域で見出される。α-サテライト配列は、それぞれの染色体は、171bpα-サテライト反復配列がさらに数個のそれぞれ染色体固有の各型を含む高次配列からなり、さらにそれが繰り返され、数メガベースにわたる長大な配列をなし配列中及び高次反覆配合における染色体特異的な変化を示す171bpのモノマーの反覆から成る。しかしながら安定なネオセントロメアが、α-サテライト等の反覆DNA配列の無い真性クロマチン領域で見出されている。
ネオセントロメアのエピジェネティカルな確立はヒト、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster)、および分裂酵母(S.pombe)で報告されており、このことはDNA-タンパク複合体の形成、特にCENP-Aヌクレオソームの形成が活性動原体の形成のために決定的に重要であることを示唆している。CENP-Aを含有するヌクレオソームは、セントロメアクロマチンを真正クロマチンまたはヘテロクロマチンから区別するものであろうし、また機能的なキネトコアの形成を促進する。本発明者らは、試験管内ヌクレオソーム再構築系においてCENP-AはヒストンH3を置き換え可能であることを示してきた。また、CENP-Aヌクレオソームの基本構造は、ヌクレオソームDNAがその周囲をまいたコアヒストンオクタマー(H3、H4、H2AおよびH2B)から構成されるH3ヌクレオソームと同様であることを示してきた。したがって、本発明者らは、CENP-Aヌクレオソーム及びその他のセントロメアタンパクから成るセントロメアクロマチン複合体がプレキネトコア複合体を構成していることを提唱する。
これらのことをより解明してゆくために、HeLa細胞からセントロメアクロマチン複合体を単離し、さらにCENP-AヌクレオソームはCENP-Bボックスを含むα-サテライト上に選択的に形成されること、及びCENP-Bおよび-CはヌクレオソームDNAと結合してA/B/Cプレキネトコアクロマチン複合体を形成することを明らかにしてゆくために、クロマチン免疫沈澱法(CHIP)などの手法が求められている。
ところで、特定のタンパク質を同定したり、単離するためには抗体を使用する方法が極めて有用である。様々な哺乳動物を用いて抗体を作製する方法が広く応用されている。抗体を用いてタンパク質複合体を単離して、その構成因子を網羅的に解析しようとするタンパク質工学いわゆるプロテオミクスを実施する上で、抗体の特異性の高さや、品質の均一性への要求が極めて高くなってきており、特にモノクローナル抗体に対する要望が大きくなってきている。
モノクローナル抗体は、抗体を産生するハイブリドーマ細胞をいったんクローン化して樹立してしまえば、その細胞は不死化した細胞(腫瘍細胞)なので永久に増殖を続け抗体を産生し続ける。従って、均一な抗体を無制限に得ることが可能となる。
しかし、従来のモノクローナル抗体の製造方法においては、目的とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別、樹立が極めて煩雑であった。とりわけ、抗原として合成されたアミノ酸鎖の比較的短いペプチドを使用する場合には、エピトープ(抗体が認識する部位)をはっきりと限定できる反面、実際に抗体として使用できるかどうかを煩雑な方法でモノクローナル抗体を作製してみなければわからないことから、多数の比較的短いペプチドを用意して煩雑な作業を長時間に亘って行わなければならなかった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、CENP-A蛋白質の抗体、その製造方法及びその利用法に関する。より詳細には、染色体のセントロメアに発現する蛋白質CENP-AのN末端の1/3のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原とするモノクローナル抗体、その製造方法、及びその利用方法に関する。また、本発明はクロマチンタンパク質の可溶化方法、及びそれを用いたクロマチンタンパク質の検出、同定、定量方法に関する。本発明の抗体は、染色体異常の検出や同定に有用であり、またセントロメアの構造や機構の解明に有用である。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
CENP-A蛋白質の3~19番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として得られる、可溶化したセントロメアクロマチンの免疫沈降法によりセントロメア複合体を単離・精製することができるモノクローナル抗体。

【請求項2】
 
CENP-A蛋白質がヒトCENP-A蛋白質である、請求項1に記載のモノクローナル抗体。

【請求項3】
 
細胞融合法によりモノクローナル抗体を製造する方法において、抗原としてCENP-A蛋白質の3~19番目のアミノ酸配列からなるペプチドを用い、ミエローマ細胞としてマウスの骨髄腫細胞であるP3-X63-Ag8.653細胞を使用し、かつ培地としてGIT培地を使用することを特徴とする、可溶化したセントロメアクロマチンの免疫沈降法によりセントロメア複合体を単離・精製することができるモノクローナル抗体を製造する方法。

【請求項4】
 
NaClの存在下にMNaseのみで可溶化したセントロメアクロマチンから、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体を用いた免疫沈降法によりセントロメア複合体を単離・精製する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Protein Structure and Functional Mechanisms -Toward Creation of Innovative Medicines, Diagnosis, and Material Production Based on Functional Mechanisms of Proteins- AREA
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