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METHOD AND APPARATUS FOR HYDROLYZING PROTEIN, AND, METHOD AND APPARATUS FOR ANALYZING PROTEIN

Patent code P09P006270
File No. 21778
Posted date Jun 5, 2009
Application number P2007-294377
Publication number P2009-120511A
Patent number P5273766
Date of filing Nov 13, 2007
Date of publication of application Jun 4, 2009
Date of registration May 24, 2013
Inventor
  • (In Japanese)堂前 直
  • (In Japanese)益田 晶子
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人理化学研究所
Title METHOD AND APPARATUS FOR HYDROLYZING PROTEIN, AND, METHOD AND APPARATUS FOR ANALYZING PROTEIN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an easily automatable method for easily hydrolyzing a protein, and to provide a highly versatile method capable of easily analyzing the amino acids of a protein.
SOLUTION: The method for hydrolyzing a protein by contacting the protein with a solid acid catalyst in the presence of water and under heating is provided. An apparatus for hydrolyzing a protein is also provided, comprising at least one hydrolysis means selected from the group consisting of a vessel, column and membrane each containing the solid acid catalyst. Besides, a method and an apparatus for analyzing a protein using the method or apparatus for hydrolyzing the protein are provided, respectively.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


タンパク質を加水分解によりペプチドやアミノ酸に分解することで、アミノ酸組成やタンパク質質量、翻訳後修飾などのタンパク質の重要な特徴を解析することができる。



一般に、タンパク質などの生体高分子は、室温下または加熱下で、水を加えた有機、無機の強酸(塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、パラ-ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸など)と混合することで加水分解され、オリゴマーやモノマー(タンパク質においてはペプチドやアミノ酸)を生じることが知られている(非特許文献1参照)。



強酸によるタンパク質の加水分解法としては、減圧封管した試験管内で定沸点塩酸(5.7NHCl)、110℃に20-72時間加熱する加水分解法(非特許文献2参照)、および、塩酸からの汚染物質の混入を防ぐために塩酸を封管試験管内で直接蒸留する変法(気相加水分解法)が広く用いられている。更に、強アルカリ(水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど)によるタンパク質の加水分解法も知られている。しかし、強酸または強アルカリによる分解は、分解物であるアミノ酸が更に分解されてしまうことがあるため、完全な加水分解法とは言えないのが現状である。例えば、塩酸加水分解ではシステインとトリプトファンが分解してしまう。



一方、酵素触媒を用いるタンパク質加水分解法も数多く開発されている。しかし、酵素分解は基質特異性があり、完全にアミノ酸まで分解できないため、用途が限定されてしまう点が課題である。また、酸加水分解時の加熱に電磁波を用いる加水分解法も提案されているが(非特許文献3参照)、電磁波を利用するため大型の装置が必要になり汎用性に乏しい点が課題である。



また、タンパク質の加水分解操作を手動で行うことで、環境からのタンパク質の混入の危険性が増えるため、微量タンパク質分析のために自動化可能な加水分解法の開発が強く求められている。塩酸加水分解法に利用可能な装置としては、加水分解、誘導体化まで自動化された装置(特許文献1参照)が開発され、市販品も発売されたが、塩酸によるバルブの腐食が原因の故障が報告されている。このように、塩酸加水分解法では、塩酸を使う性質上自動化は困難を極めている。
【特許文献1】
米国特許公報第 5,106,583号
【非特許文献1】
日本生化学会編 生化学実験講座1タンパク質の化学II一次構造決定法 東京化学同人、pp30-40完全加水分解 執筆担当 高橋礼子、pp96-101 水酸化ナトリウムによるタンパク質の加水分解 執筆担当 高橋礼子 日本生化学会編
【非特許文献2】
"The amino acid composition of ribonuclease" C.H.W.Hirs, W.H.Stein and S.Moore J.Biol.Chem.211 941-950 (1954)
【非特許文献3】
"Peptide and protein hydrolysis by microwave irradiation" Shyh-Horng Chiou and Kung-Tsung Wang J.Chromatogr. 491,424-431(1989)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、タンパク質の加水分解方法および装置に関するものであり、より詳しくは、簡便かつ容易にタンパク質を加水分解し得る方法および装置に関するものである。
更に本発明は、タンパク質の分析方法および装置に関するものであり、より詳しくは、タンパク質のアミノ酸分析を簡便に行うことができる汎用性に優れた方法および装置に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
固体酸触媒とタンパク質とを水存在下かつ加熱下で接触させることにより、該タンパク質を加水分解することを含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解方法。

【請求項2】
 
固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である請求項1に記載のタンパク質加水分解方法。

【請求項3】
 
スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である請求項2に記載のタンパク質加水分解方法。

【請求項4】
 
前記加熱は、100~160℃の範囲の温度で行われる請求項1~3のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解方法。

【請求項5】
 
固体酸触媒を含む容器、カラムおよび膜からなる群から選ばれる少なくとも一種の加水分解手段を含み、前記固体酸触媒はスルホン酸基を有する多孔質体であることを特徴とするタンパク質加水分解装置。

【請求項6】
 
固体酸触媒は、スルホン酸型陽イオン交換体である請求項5に記載のタンパク質加水分解装置。

【請求項7】
 
前記加水分解手段を加熱するための加熱手段を更に含む請求項5または6に記載のタンパク質加水分解装置。

【請求項8】
 
前記加水分解手段へ溶液を送液するための送液手段を更に含む請求項5~7のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置。

【請求項9】
 
スルホン酸型陽イオン交換体は、親水性ビニルポリマーを基材として含むスルホン酸型陽イオン交換樹脂である請求項5~8のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置。

【請求項10】
 
請求項1~4のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解方法または請求項5~9のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置を使用することによりタンパク質加水分解物を得ること、および、
上記タンパク質加水分解物を分析すること、
を特徴とするタンパク質分析方法。

【請求項11】
 
前記分析は、アミノ酸分析を含む請求項10に記載のタンパク質分析方法。

【請求項12】
 
請求項5~9のいずれか1項に記載のタンパク質加水分解装置と、加水分解物分析手段と、を含むことを特徴とするタンパク質分析装置。

【請求項13】
 
前記加水分解物分析手段は、アミノ酸分析手段を含む請求項12に記載のタンパク質分析装置。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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