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METHOD FOR SEPARATING/DETECTING PROTEIN OR THE LIKE

Patent code P09A014845
Posted date Nov 20, 2009
Application number P2007-085384
Publication number P2008-237163A
Patent number P5055551
Date of filing Mar 28, 2007
Date of publication of application Oct 9, 2008
Date of registration Aug 10, 2012
Inventor
  • (In Japanese)末田 慎二
  • (In Japanese)田中 一史
  • (In Japanese)近藤 寛樹
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人九州工業大学
Title METHOD FOR SEPARATING/DETECTING PROTEIN OR THE LIKE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for separating/detecting a protein or the like, in which a protein tag system having a bond with high specificity is utilized.
SOLUTION: The method for separating/detecting the protein or the like includes forming a conjugate from (A) a biotin-immobilizing enzyme derived from archeal Sulfolobustokodaii and (B) a fused protein of a biotin-carrying protein derived from the archaea and biotinylated by catalytic action of the biotin-immobilizing enzyme with a target protein or forming a conjugate from the biotin-immobilizing enzyme (A), the fused protein (B) and (C) a substance having a binding affinity with the target protein and then separating/detecting the target protein or the target protein and the substance (C) having binding affinity with the target protein.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


プロテインタグシステムは、タンパクの精製方法並びに分析方法として、幅広い分野で活用されている。この手法では、タグとばれる比較的低分子量のタンパクやペプチドと、目的のタンパクを融合させて細胞内で発現させ、その後、タグを認識する物質を固定化した固相担体を利用して、目的のタンパクを捕捉し精製する方法である。この際、細胞内で目的のタンパクに結合していたタンパク質も同時に捕捉することが可能であるため、タンパク間相互作用の解析にも活用されている。更に、タグを有する目的タンパクを同様の原理で固相担体に固定化し、その後、その固相担体上で目的タンパクと他の物質(タンパク等)との間の相互作用を解析することも可能である。



このような目的に使用するタグとして、これまでに様々なものが開発されてきたが、代表的なものとしては次の様なものがある。(1)抗体によって認識されるペプチドあるいはタンパク(エピトープ)をタグとして利用し、抗体を固定化した固相担体を利用する系(例えば、非特許文献1参照)、(2)ビオチン化ペプチドあるいはタンパクをタグとして利用し、アビジンあるいはストレプトアビジンを固定化した固相担体を利用する系が挙げられる(例えば、非特許文献2、特許文献1、2参照)。
【非特許文献1】
Brizzard, B., L. et al. Biotechniques (1994) 第16巻 第4号p. 730-735
【非特許文献2】
Rodriguez, P. et al. Methods Mol Biol. (2006) 第338巻 p. 305-323
【特許文献1】
特表2005-516074号公報
【特許文献2】
特開2003-153698号公報



しかし、これらの系には問題点が存在する。それは、まず抗体を利用する系の場合、アミノ酸残基間のみの結合を利用しているため、本質的に交差反応性を示し、目的タンパクではない他のタンパクとの結合が起こり得ることである。また、アビジンを利用する系の場合、アビジンはビオチンのみを認識して結合するため、細胞内に元々存在するビオチン化タンパクもすべて結合することになる。従って、これらの既存の手法には結合特異性という観点から改善の余地がある。また、これらの既存の手法では、目的タンパクを固相担体上に捕捉した後、それを溶出させるのに何らかの添加剤が必要であり、精製や解析に手間がかかっている。更に、抗体やアビジンは大腸菌などの原核生物の発現系を利用して調製することが困難であるため、結果として、価格が非常に高額であることも問題点として挙げられる。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素によるビオチン化反応を利用した、タンパク等の分離・検出方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン固定化酵素(A)と、該ビオチン固定化酵素の触媒作用によってビオチン化された、スルホロバス・トウコウダイ(Sulfolobus tokodaii)由来のビオチン担持タンパクと目的タンパク質との融合タンパク(B)とから複合体を形成させ、又は、前記ビオチン固定化酵素(A)と、前記融合タンパク(B)と、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とから複合体を形成させ、該複合体として、前記目的タンパク、又は、前記目的タンパクと前記目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とするタンパク等の分離・検出方法。

【請求項2】
 
ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)を解離させ、該融合タンパク(B)として目的タンパクを分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法。

【請求項3】
 
ビオチン固定化酵素(A)と融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)とからなる複合体を加温して、ビオチン固定化酵素(A)から、融合タンパク(B)と目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を解離させ、該融合タンパク(B)に含まれる目的タンパクと、目的タンパクと結合親和性を有する物質(C)を分離・検出することを特徴とする請求項1項記載のタンパク等の分離・検出方法。

【請求項4】
 
目的タンパク質が、ビオチン担持タンパクの活性領域と融合した融合タンパクを形成していることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法。

【請求項5】
 
ビオチン固定化酵素(A)として、固相担体に固定化されたものを用いることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項記載のタンパク等の分離・検出方法。


IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2007085384thum.jpg
State of application right Registered
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