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METHOD FOR INTRODUCING AMINO ACID TO TARGET PROTEIN OR TARGET PEPTIDE commons meetings

Patent code P09A014955
File No. OP00375
Posted date Jan 15, 2010
Application number P2008-181303
Publication number P2009-106268A
Patent number P5279378
Date of filing Jul 11, 2008
Date of publication of application May 21, 2009
Date of registration May 31, 2013
Priority data
  • P2007-265900 (Oct 11, 2007) JP
Inventor
  • (In Japanese)瀧 真清
  • (In Japanese)宍戸 昌彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人 岡山大学
Title METHOD FOR INTRODUCING AMINO ACID TO TARGET PROTEIN OR TARGET PEPTIDE commons meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for readily introducing an amino acid to a target protein or a target peptide, at low cost, and enabling the introduction of the amino acid to the target protein or the target peptide to be increased in scale.
SOLUTION: The method for introducing the amino acid to the target protein or the target peptide includes allowing (1) the target protein or the target peptide, (2) the amino acid to be introduced, (3) tRNA, (4) an aminoacyl-tRNA synthetase and (5) an aminoacyl-tRNA protein transferase to be present in the same mixed solution, in a single container.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


タンパク質の機能解析などの目的のため、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変することが、遺伝子工学的な手法により、比較的古くから行われている。また、天然のアミノ酸のみならず、非天然のアミノ酸をタンパク質へ導入することも行われている。非天然アミノ酸導入により、タンパク質の構造・機能の解析のみならず、何らかの機能を人工的に付加した人工的なタンパク質の作製も可能になる。



機能性基をタンパク質表面に導入する場合、一般に用いられるのがタンパク質の特定残基への化学修飾である。また、近年タンパク質中のアミノ酸残基の置換が可能となったため、タンパク質合成系を拡張することで、アミノ骨格を有する所望の非天然型アミノ酸をタンパク質中に導入することが可能となった。



タンパク質合成系を用いずに、酵素的に非天然アミノ酸をtRNAに結合させる方法が開示されている(非特許文献1および2)。目的タンパク質と非天然アミノ酸によりアミノアシル化されたtRNAとを、ロイシル/フェニルアラニルタンパク質転移酵素の存在下で混合すると、目的タンパク質のN末端だけに非天然アミノ酸が転移することが見出された。



また、tRNAの3'末端に様々な非天然アミノ酸を結合させる酵素として、アミノアシルtRNA合成酵素変異体が作製されている(非特許文献3)。かかる酵素を用いて、翻訳系により非天然アミノ酸をタンパク質もしくはペプチドに導入する方法が開示されている(特許文献1)。
【特許文献1】
国際公開WO03/073238号
【非特許文献1】
Chembiochem, 2006, 7, 1676-1679
【非特許文献2】
Biopolymers, 2007, 88, 263
【非特許文献3】
Chembiochem, 2002, 02-03, 235-237

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法に関する。さらには、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入するためのキットおよび、前記アミノ酸を導入する方法もしくは導入キットを用いて非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
少なくとも以下を含む混合溶液を用いて、目的タンパク質または目的ペプチドにアミノ酸を導入する方法:
1)目的タンパク質または目的ペプチド、
2)導入するアミノ酸であり、フッ素を含有するアミノ酸、
3)tRNA、
4)アミノアシルtRNA合成酵素、
5)アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。

【請求項2】
 
混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとtRNAのモル比が、30:1~1:1である請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
混合溶液中における目的タンパク質または目的ペプチドとアミノアシルtRNA合成酵素のモル比が、100:1~2:1である請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素が、ロイシル/フェニルアラニルtRNAタンパク質転移酵素である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
目的タンパク質または目的ペプチドのN末端が塩基性アミノ酸であり、導入するアミノ酸が目的タンパク質または目的ペプチドのN末端に導入される、請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
アミノアシルtRNA合成酵素が、大腸菌由来フェニルアラニルtRNA合成酵素の294番目のアラニンがグリシンに置換した変異体である請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
 
フッ素を含有するアミノ酸が、以下から選択される少なくとも1以上のアミノ酸である請求項1~6のいずれか1項に記載の方法:
2-アミノ-3-(4-フルオロメトキシ-フェニル)-プロピオン酸;
2-アミノ-3-[4-(2-フルオロ-エトキシ)-フェニル]-プロピオン酸。

【請求項8】
 
少なくとも以下を含む請求項1~7のいずれか1項に記載の方法に用いる、目的タンパク質または目的ペプチドへのアミノ酸導入用キット:
1)tRNA、
2)アミノアシルtRNA合成酵素、
3)アミノアシルtRNAタンパク質転移酵素。

【請求項9】
 
請求項1~7のいずれか1項に記載の方法または請求項8に記載のキットを用いる、非天然タンパク質または非天然ペプチドを製造する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2008181303thum.jpg
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