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METHOD FOR STERILIZING ROTIFERA MONOGENITAL EGG

Patent code P09A015038
File No. P2004-179-JP01
Posted date Feb 19, 2010
Application number P2005-052347
Publication number P2006-230328A
Patent number P4682291
Date of filing Feb 28, 2005
Date of publication of application Sep 7, 2006
Date of registration Feb 18, 2011
Inventor
  • (In Japanese)吉水 守
  • (In Japanese)渡辺 研一
  • (In Japanese)桑田 博
  • (In Japanese)小磯 雅彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北海道大学
Title METHOD FOR STERILIZING ROTIFERA MONOGENITAL EGG
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple method for sterilizing rotifera monogenital eggs, which can easily be applied to fish or shellfish seedling production sites needing large amounts of rotiferas in high hatching rates and in high sterilization rates, and by which fish or shellfish bacterial diseases originated from the rotiferas can be reduced.
SOLUTION: This method for sterilizing the rotifera monogenital eggs is characterized by immersing the rotifera monogenital eggs in a glutar aldehyde solution to sterilize the rotifera monogenital eggs, preferably immersing the rotifera monogenital eggs in natural seawater or artificial seawater (concentration of about 60%) containing glutar aldehyde in a concentration of 1,000 to 2,000 mg/L.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


我が国では、2001年度に51種類の海産魚介類の種苗生産が行なわれ、多くの種でシオミズツボワムシ(Brachionus plicatilis) などの輪虫類(本発明ではこれら輪虫類のことを「ワムシ」と記す。)の給餌が必須となっている。一方、ワムシが感染源として疑われる細菌性疾病の発生が報告されており、ワムシ由来で種苗生産対象種に疾病が発生することを防除する技術の開発が緊急の課題となっている。そのためには、餌料として供給するワムシの病原体による汚染レベルを低くすることが必要である。



ワムシの病原体による汚染レベルを低くするためには、ワムシ培養に使用する用水・水槽・器具・餌料及び最初に接種するワムシの元種などを消毒する必要がある。ワムシの培養水や水槽・用具などの培養環境の消毒技術はすでに確立されている。しかしながら、餌料や元種の消毒法については未検討であるため、これらの消毒技術を早急に確立する必要がある。



【特許文献1】
特開平07-79659号公報
【特許文献2】
特開平11-98965号公報
【非特許文献1】
水産庁/社団法人日本栽培漁業協会発行昭和63年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズNo.8『シオミズツボワムシ培養に関する最近の知見』(平山和次著)
【非特許文献2】
水産庁/社団法人日本栽培漁業協会発行昭和62年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズNo.1『クロレラの大量培養と水産への利用』(ヤクルト本社・深田哲夫著)
【非特許文献3】
Aquaculture Research (1997) vol.28, 559-565, Balompapueng et al.
【非特許文献4】
Aquaculture (1999) vol.176, 195-207, G.Rombaut et al.



特許文献1にはワムシ類の高密度大量培養法が開示されている。また、特許文献2には高密度培養ワムシの栄養強化法について開示されている。しかしながら、特許文献1にも特許文献2にも、ワムシの単性生殖卵を消毒する方法については何ら記載されていない。



以下の非特許文献にはワムシの卵を消毒する方法が散見される。すなわち、非特許文献1には、ワムシの初産卵を採取して洗浄し、抗生物質含有液を滅菌海水に対して2対10の割合で加えたものに約3時間浸漬する操作を数回繰り返した後、さらに滅菌海水中に移して放置することを繰り返して無菌のワムシを得る方法が開示されている。また、非特許文献2には、ワムシの単性生殖卵を0.1%Tween80添加培地で3回洗浄した後、遠沈洗浄し、ペニシリン500μg/mL、ストレプトマイシン625μg/mLを含む培地に25℃で24時間浸漬した後、遠心分離して無菌ワムシを得る方法が開示されている。しかし、これらのワムシの卵の消毒方法はふ化率が明らかでない上、上記のとおり、複雑な操作を繰り返す必要があるため手間がかかるので、大量の元種を得る目的には適さない。また、この操作によって得られたワムシは、必ずしも無菌になるとは限らない。



なお、ワムシ耐久卵の消毒法に関しては、非特許文献3と非特許文献4に報告されている。すなわち、非特許文献3には、1mg/L(0.0001%)の次亜塩素酸ナトリウムでワムシ耐久卵を60分間処理することにより、無処理のものよりもふ化率が向上し、SEMにより卵表面に細菌が観察されなくなったことが報告されている。しかしながら、単性生殖卵に対する次亜塩素酸ナトリウムの毒性が確認されているため、この方法は何ら参考になるものではない。



また、非特許文献4には、0.05μL/L(0.05mg/L)のグルタルアルデヒドでワムシ耐久卵を6時間処理することにより、無処理のものとふ化率に差がなく、細菌が検出されなくなった旨が報じられている。すなわち、非特許文献5のTable 2 (200頁)
には、ワムシの耐久卵をメチルオレイト又はグルタルアルデヒドを用いて殺菌する場合、グルタルアルデヒド液を0.05~0.25μL/Lという極めて薄い濃度にして耐久卵を約6時間浸漬すると、50~32%程度のふ化率を示し、細菌は検出されなかった旨が開示されている。



しかしながら、非特許文献4に記載の方法をワムシ単性生殖卵に適用すると、単性生殖卵を消毒剤中に6時間も浸漬することになるので、この間にほとんどの卵がふ化してしまう。すなわち、ワムシ単性生殖卵の消毒では、発育段階を揃えることが非常に困難であるため、消毒中にもふ化する卵があり、長時間の消毒には問題がある。本発明者らの知見では、単性生殖卵の薬剤浸漬は40分間程度が限界であると考えられる。しかも、単性生殖卵からふ化したワムシは、薬剤に極端に弱いため、この方法では多くのワムシが死亡してしまい、ふ化率が低下することになる。



すなわち、ワムシの卵は、単性生殖卵(正確には複相単性生殖卵)と耐久卵に大別されるが、単性生殖卵は雌が単性生殖により産出して急激な増殖をもたらすのに対して、耐久卵は雄の出現による両性生殖により産出されて休眠をもたらす。消毒剤に対する耐性は耐久卵の方がはるかに大きい。なお、両性生殖の起こり易さはワムシの株によって異なる。



このように、ワムシの単性生殖卵と耐久卵では消毒剤に対する感受性が大きく異なるため、種苗生産の現場において元種となるワムシを得るための卵の消毒に耐久卵の消毒法をそのまま用いることは非常に危険である。すなわち、ワムシ耐久卵は肥厚した第2次卵膜を備えているため、外部環境の変化に極めて強い耐久性を示し(そのため「耐久卵」と呼ばれている。)、例えば塩素による消毒も可能であるのに対し、ワムシ単性生殖卵は第1次卵膜しか有しないため、外部環境の変化に弱く、塩素消毒に耐え得ないことが知られている(水産学シリーズ44「シオミズツボワムシ-生産学と大量培養」22頁参照)。また、ワムシの耐久卵は長期の保存が可能であるのに対し、ワムシの単性生殖卵はほとんど保存ができない。例えば、耐久卵は、淡水で洗浄して3年間保存した乾燥卵でもふ化が認められる。さらに、耐久卵は、0~5℃の暗い海水中で8年間保存してもふ化が認められるが、単性生殖卵はふ化時間が15℃で1~2日、20℃で1~1.5日、25℃で0.5~1.0日、30℃で3~18時間というように直ちにふ化し、保存することができない(福所邦彦・平山和次共同編集「初期餌料生物-シオミズツボワムシ」参照)。このように、同じワムシの卵であっても、耐久卵と単性生殖卵では生態学的な相違が極めて大きく、消毒剤に対する感受性が異なるため、魚介類種苗生産の現場で、耐久卵の知見をそのまま単性生殖卵に適用できないことは、言わば技術常識とされている。



一方、現在我が国の魚介類種苗生産機関で培養されているワムシは、増殖性の良さを基準として選抜が行なわれているため、単性生殖卵を生じる株を用いている機関が多く、耐久卵を生じる株を用いている機関は非常に少ないものと推察される。



したがって、耐久卵の消毒技術とは無関係に、ワムシ単性生殖卵独自の消毒技術を確立する必要がある。特に、ワムシを大量に必要とする魚介類種苗生産の現場に適するワムシの卵の消毒方法を開発する必要がある。しかし、ワムシ単性生殖卵の消毒方法ないし殺菌方法はいまだ確立されていない。本発明者らは、ワムシ単性生殖卵の各種消毒剤に対する感受性と消毒効果について繰り返し試験・検討を行なった結果、ようやくにして本発明を完成するに至った。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。詳しくは、ワムシの単性生殖卵について、高いふ化率と消毒率が得られる消毒方法に関する。さらに詳しくは、ワムシ由来の病原体による魚介類の細菌性疾病を予防するために有効なワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド1000~2000mg/Lを含む天然海水又は人工海水に20~40分間浸漬して消毒することを特徴とするワムシ単性生殖卵の消毒方法。

【請求項2】
 
請求項1に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド1000mg/L含む60%濃度の人工海水に30~40分間浸漬する方法。

【請求項3】
 
請求項1に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド1250mg/Lを含む60%濃度の人工海水に20~40分間浸漬する方法。

【請求項4】
 
請求項1に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド1500~2000mg/Lを含む60%濃度の人工海水に20~30分間浸漬する方法。

【請求項5】
 
マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビの仔魚に給餌するワムシを得るための、請求項1から4のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。

【請求項6】
 
魚介類種苗生産の現場において仔魚に給餌するワムシの大量培養に使用する元種を得るための、請求項1から4のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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24821_01SUM.gif
State of application right Registered
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