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METHOD FOR CULTURING HARDLY CULTURABLE MICROORGANISM

Patent code P09A015311
File No. P08-003
Posted date Mar 5, 2010
Application number P2008-038090
Publication number P2009-195124A
Patent number P5374750
Date of filing Feb 19, 2008
Date of publication of application Sep 3, 2009
Date of registration Oct 4, 2013
Inventor
  • (In Japanese)田中靖浩
  • (In Japanese)森 一博
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山梨大学
Title METHOD FOR CULTURING HARDLY CULTURABLE MICROORGANISM
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for culturing and separating by which even hardly culturable microorganisms that are difficult to culture and separate with a conventional culture medium can efficiently be proliferated.
SOLUTION: In the method for culturing the hardly culturable microorganisms, the hardly culturable microorganisms (hereinafter referred to as the hardly culturable microorganisms) existing in the natural world, and difficult to culture is attached to roots of sterile plants of the family Lemnaceae, culturing the microorganisms together with the sterile plants of the family Lemnaceae in a liquid culture medium, and then carrying out separation from the culture medium. Even microorganisms which cannot be separated and cultured by a conventional method for culturing can be cultured and separated by the method.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


自然環境中には多くの微生物が生息しており、その種類は300,000~1,000,000種にのぼると言われている(Tiedge; ASM News 60, 524-525(1994))。
微生物を分離、培養化する方法としては平板培養法が最も多く用いられているが、これまでに、この方法をベースとした様々な培養方法によって単離した微生物の中から、産業上有用な微生物が数多く分離され、利用されてきた。
しかし、蛍光顕微鏡を用いた分離源中の全菌数計数法の確立により、自然環境中に存在する微生物のほとんどが従来の微生物分離、培養法では培養困難な、いわゆる難培養性微生物であることが明らかとなってきた。
例えば、様々な環境試料中の顕微鏡観察による全菌数に対する平板培養法での生菌数は海水で0.0001~0.1%、湖沼水で0.25%、活性汚泥で1~15%、土壌で0.3%に過ぎないという報告がある(Amann; Microbiol. Rev. 59, 143-169(1995))。
また、主に16S rRNA遺伝子に基づいた分子生物学的手法により、従来の培養法で培養されていない難培養生微生物の多くは未知の新規微生物であることが推察されている。(Hugenholtz; J. Bacteriol. 180, 4765-4774(1998))。
即ち、実際には数千程度の種の数しか培養されてはいないのが実体であり、大部分の天然の微生物は実験室での培養が難しいのが現状である。このような“非培養種”は天然のすべての微生物の99~99.99%にものぼるともいわれている。
このような未知の新規微生物には未だに知られていない新規な機能を有するものが存在すると想定され、それらの食品産業、医薬品産業、水質浄化等の環境保全、医療分野等への利用が強く望まれている。
難培養性微生物を分離、培養化する技術に関しては、例えばカタラーゼやシステイン化合物等を含む平板培地を用いる方法が知られている。(特許文献1)。
しかし、自然環境中に生息する多種多様な難培養性微生物の中にはこのような方法によっても分離、培養化できないものがまだ数多く存在することが想定される。
これらの難培養性微生物が培養困難な理由としては、例えば、自然環境中で共生関係を構築している他の生物(微生物、植物、動物、昆虫等)が分離培養時に欠落している、分離培養に用いる培地の栄養条件の最適化が不十分である等が挙げられる。
一方、われわれの研究により、ウキクサ科の植物は様々な水環境、例えば、水田、池、沼、湖、河川等に広く分布する浮遊性の水生植物であるが、例えば、ウキクサ(学名:Spirodela polyrrhiza)の場合、その根から、試料として用いた個体が生息していた自然環境から分離、培養される微生物と比べて、より多くの種類の微生物が分離、培養され、その30~35%が新種微生物であるという知見が得られた。
このことから、ウキクサはそれらが生息する水環境中に分布する難培養性微生物を培養可能な状態にする能力を持つ可能性が示唆されるが、その能力を利用した種々の環境試料からの難培養性微生物の分離、培養化に関する知見はこれまでに全く報告されていない。



【特許文献1】
特開2004-89016 号公報

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、自然環境中生息しているが、培養困難な微生物(難培養性微生物)の培養方法、及び分離方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
微生物を含有する環境サンプルを用意し、無菌ウキクサ科植物の根を前記環境サンプルの溶液に一定期間浸し、前記根に微生物を付着させ、共培養した後、前記根に付着した微生物を採取し、この微生物を微生物分離・培養用培地にて培養した後、前記微生物分離・培養用培地より分離することを特徴とする難培養性微生物の分離方法。

【請求項2】
 
前記環境サンプルを採取された環境が、淡水、海水、堆積物および土壌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の難培養性微生物の分離方法。

【請求項3】
 
前記無菌ウキクサ科植物がウキクサ科のSpirodela polyrrhizaであることを特徴とする請求項1又は2に記載の難培養性微生物の分離方法。

IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2008038090thum.jpg
State of application right Registered
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