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微粒子およびその製造方法 新技術説明会

国内特許コード P09A015319
整理番号 IP19-118
掲載日 2010年3月12日
出願番号 特願2009-059789
公開番号 特開2009-256324
登録番号 特許第5429707号
出願日 平成21年3月12日(2009.3.12)
公開日 平成21年11月5日(2009.11.5)
登録日 平成25年12月13日(2013.12.13)
優先権データ
  • 特願2008-084310 (2008.3.27) JP
発明者
  • 奥 浩之
  • 俵 義宣
  • 山田 圭一
  • 片貝 良一
  • 佐藤 久美子
  • 鈴木 守
  • 矢野 和彦
  • 狩野 繁之
出願人
  • 国立大学法人群馬大学
発明の名称 微粒子およびその製造方法 新技術説明会
発明の概要 【課題】生理活性物質含有微粒子を効率よく製造する。
【解決手段】生理活性物質を含む揮発性有機酸水溶液または生理活性物質の揮発性有機酸溶液を、生分解性高分子を含む揮発性有機溶媒と混合してエマルジョンを作製する工程、及び得られたエマルジョンを負電荷を有するポリマーの水溶液と混合する工程を含む、生理活性物質含有微粒子の製造方法。
【選択図】図5
従来技術、競合技術の概要


[従来技術とその問題点]
(1)感染症としてのマラリアの現況
マラリアは地球上に於いて最も重大な原虫感染症の一つである。熱帯地域と亜熱帯地域の
流行地域を中心に、毎年3億人の感染者と200万人以上の死亡者が報告されている。また近年は、地球規模での経済活動の拡大により人や物資の移動が盛んになってきている。これに伴い、日本人渡航者が流行地で感染する例や、流行地から日本への入国者が国内で発症する輸入マラリアの症例が、1980年代より急激に増えている(非特許文献1)。このためマラリア対策は、流行地のみならず日本に於いても緊急の課題となっている。



ヒトにマラリアを引き起こすPlasmodium属の寄生原虫は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)の4種類である。原虫を媒介する蚊の刺咬により体内に入ったマラリア原虫は血中から速やかに肝細胞に侵入し(一次肝臓内ステージ、図1a)、肝細胞内で分裂・増殖してから血中に放出され、赤血球内に侵入して分裂増殖を繰り返し(赤血球内サイクル、図1b)、増殖した原虫は他の蚊によってさらに伝搬されてゆく(図1c)。マラリアによる発熱の症状は赤血球内サイクルによって引き起こされる。特に熱帯熱マラリアは他の3種に比較して治療が遅れると重症化と死亡の危険をもたらす。



またマラリアは健康問題のみならず、アフリカ諸国での経済活動の停滞と社会不安の一因ともなっている。流行地に於ける近年の感染者の増加は、熱帯雨林開発や温暖化との関連も指摘され、International Panel on Climate Change報告(1996 & 1998)によると地球温暖化の場合2℃の温度上昇で5000-8000万人の増加が予測されている。そのため、第二次大戦後にDDT散布と衛生対策によって根絶したはずの日本を含む温帯地域においても、マラリア再流行が懸念されている。



(2)治療薬による薬剤耐性や副作用の問題:
薬剤耐性マラリアの分子メカニズム 1945年代から全世界に普及した特効薬クロロキンへの薬剤耐性が、早くも1957年にコロンビアとタイ-ミャンマー国境から同時に報告された。以後、クロロキン耐性原虫は全世界に拡散し、流行地域に於けるマラリア対策を極めて困難にしている。



現在クロロキンはほとんど使われないが、その薬剤耐性メカニズムは長い間不明であった。流行地での調査と組み合わせて、熱帯熱マラリア原虫のクロロキン耐性には幾つかの蛋白の遺伝子変異(pfmdr(非特許文献2)、cg2(非特許文献3)、pfcrt(非特許文献4))の関与が示唆され、ようやく分子レベルで理解され始めてきた(非特許文献5)。クロロキンは少ない投与量でも、赤血球内の原虫にある酸性の食胞中へ濃縮される。この食胞はヘモグロビンを消化分解してアミノ酸を利用し、副生物であるヘムをヘモゾインとして無毒化する。クロロキンは栄養とならないヘム副生物であるヘモゾインの形成を阻害する。即ち原虫はヘムを無毒化できずに死滅する。しかし耐性原虫の食胞内ではクロロキ
ンの半減期はわずか数分であり、急速な薬物排出により耐性を発現する。



現在のマラリア治療にはベトナム戦争で開発された化合物(メフロキン)が多く使用されている。最新の治療薬は2000年に米国で認可されたマラロンであるが、これも既存薬の転用である。現在は漢方薬の成分から発見された治療薬、アルテミシニンとその誘導体が注目されている(National Geographic誌 2007年7月号; Nature誌 2004年8月19日号(非特許文献6))



しかしマラリア原虫殺作用のある薬剤は頭痛、吐き気など副作用の非常に強いものが多い。そのため予防内服は一般に薦められていない。実際、既存の化合物(キニーネ、クロロキン)は劇物である。これに対し、抗原ペプチドや生分解性高分子を原料にするワクチンはアミノ酸やヒドロキシカルボン酸を成分とするため、目的の予防免疫反応のみを起こし、既存治療物質に見られる強い毒性がない。



このように従来技術では、マラリアの予防や治療に多くの問題を抱えている。そのため、予防法として安全で安価なワクチンによる予防接種が望まれている。しかし現在までに市販されたワクチンはない。



(3)マラリアワクチン開発の現況と問題:
マラリアワクチンの開発が始まったのは比較的最近である(1978年以降)。現在、国内・海外を含めてワクチンを指向した研究が精力的に進められている。しかし臨床応用されている例は一つもない。報告されている論文によれば、世界中で十数グループが臨床試験へ進みつつある(非特許文献7)。その他に日本国内の研究ではおよそ3グループがワクチンを目指して臨床試験およびその準備を進めている(第73回日本寄生虫学会大会、シンポジウム「日本のマラリアワクチン研究」、2004年4月24日、前橋市)。



これまでのマラリアワクチン開発の研究報告を精査すると、マラリアワクチン開発が困難な理由は、マラリア原虫が進化の過程で獲得された複雑な免疫回避システムを持つことに加えて、マラリアの臨床症状は感染者の免疫状態によって大きく異なるためワクチン効果の判定が難しいこと、が原因と考えられる。すなわち従来技術では、流行地における住民それぞれに異なる免疫状態や、非流行地からの渡航者で免疫の全くない状態など、免疫状態の差を考慮したワクチン開発がされていない点に限界がある。



(4)エマルジョン法による高分子微粒子の現況:
近年、生分解性高分子(ポリ乳酸-グリコール酸共重合体など)を用いた、ダブルエマルジョン法またはシングルエマルジョン法によって作製される高分子微粒子が、生理活性物質の封入を目的として多く研究されている。ダブルエマルジョン法では水相-有機相-水相 (W/O/W)の3つの溶液を用いて、薬物を封入した微粒子を形成させる。シングルエマルジョン法では有機相-水相 (O/W)の2つの溶液を用いて、薬物を有機層に溶解、封入した微粒子を形成させる。



従来のダブルエマルジョン法では、例えば、非特許文献8に記載のように、少量の生理活性物質(25 mg)の水溶液(250μL)を生分解性高分子(ポリ乳酸-グリコール酸共重合体、250 mg)の揮発性有機溶媒溶液(ジクロロメタン、5 mL)と撹拌乳化させる。ここでは生理活性物質を含む内水相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなW/Oエマルジョンに、大量のポリビニルアルコール水溶液(8~12%)を注入(25 mL)して撹拌をつづける。すると生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して、溶解度が低下するために、生分解性高分子が内水相をとり囲むように析出して微粒子を形成する。



従来のシングルエマルジョン法では、例えば少量の生理活性物質(25 mg)を生分解性高分子(ポリ乳酸-グリコール酸共重合体、250 mg)の揮発性有機溶媒溶液(ジクロロメタン、5 mL)と撹拌溶解させる。ここでは生理活性物質が均一なジクロロメタン溶液になる点がダブルエマルジョン法と異なる。このような有機相に、大量のポリビニルアルコール水溶液(1~20%)を注入(25 mL)して撹拌をつづける。するとここでは生理活性物質と生分解性高分子を含む有機相が、はげしい攪拌によって微小滴に分散される。このようなO/Wエマルジョンにおいて、生分解性高分子を溶かしていた揮発性有機溶媒が蒸発して溶解度が低下するために、生分解性高分子が生理活性物質を含んだまま析出して微粒子を形成する。



ポリビニルアルコールは微粒子の表面を負に帯電させて、形成した微粒子が凝集することを防ぐ役割を持っている。濃度は1~10%程度が多く用いられる。しかしながら、ポリビニルアルコールは薬理学的に許容される物質であるが、生分解性にやや乏しいビニルポリマー型の高分子であるため、ワクチンを考える場合はなるべく低濃度であることが望ましい。



(5)微粒子を用いたマラリアワクチン開発の現況:
世界で初めてマラリアワクチンのフィールドトライアルを行ったのはコロンビアのManuel E. Patarryoらである(非特許文献9、10)。これはSPf66抗原と呼ばれ、45残基のアミノ酸配列からなる化学合成ペプチドを抗原として用いている。



SPf66に用いられているアミノ酸配列はメロゾイトやスポロゾイトと呼ばれる赤血球や肝臓へ寄生する段階の原虫が用いているタンパク質の部分アミノ酸配列に由来している。SPf66を含めて、一般にワクチン開発に用いられている標的抗原は、マラリア原虫が、(a)赤血球への侵入するためのタンパク質、(b)原虫や感染赤血球の表面に提示するタンパク質が多く用いられている。このように従来技術では、ワクチン開発は原虫表面や原虫の寄生時の構造形成に関与する構造タンパク質を用いる例が多い。



SPf66抗原ははじめ、南アメリカ、タンザニアでのフィールドトライアルにおいて感染防御に成功した(非特許文献11)。しかしながら、その後のガンビアやタンザニアで行われた他のフィールドトライアルでは、防御効果が見られなかった(非特許文献12)。これは上記のように、マラリアの臨床症状が感染者の免疫状態によって大きく異なるため、ワクチン効果の判定が難しいことに原因している。



一方Patarroyoらを含む関連研究グループでは、このワクチン効果の差違を、ワクチン接種時に用いるアラムと呼ばれる水酸化アルミニウムの水性懸濁液を、免疫反応を増強するアジュバントとして用いたことに原因があると考えている。



そこでPatarroyoとPedrazらのグループはアラムに代わるアジュバントとして高分子微粒子に着目し、SPf66抗原を蒸留水に溶解させた水溶液を内水相とした、ダブルエマルジョン法によって、マイクロ微粒子の作製と免疫学的性質の研究を行っている(非特許文献13)。ここで報告されている微粒子の高分子基剤にはポリ乳酸-グリコール酸共重合体(共重合比50:50または75:25、重量平均分子量9~10万)を用い、直径およそ0.1~2.0μmと分布の広い微粒子(平均1.3~1.4μm)が得られている(非特許文献14)。また、外水相の8%ポリビニルアルコール水溶液を12%水溶液にすることで平均直径が0.5μmに縮小した微粒子が報告されている(非特許文献15)。



しかしながら、PatarroyoとPedrazらの方法によるワクチン抗原の高分子微粒子を用いたワクチン開発は、(a)構造タンパク質を抗原としている、(b)被験者の免疫状態の差違を考慮していない、(c)蒸留水に抗原を溶解させる必要がある、(d)高濃度のポリビニルアル
コール水溶液を用いている、(e)微粒子の大きさがマイクロメートルサイズのみである、(f)大きさにばらつきが大きい、ことで限界がある。



(6)エマルジョン法による高分子ナノ・マイクロ微粒子形成の現況:
エマルジョン法を用いたナノメートルサイズの高分子微粒子の作製法としては、アクリル酸ポリマーを用いた方法(非特許文献16)とポリ乳酸-グリコール酸共重合体を用いた方法(特許文献1)の2つが知られている。薬物を微粒子に内包させる際に、薬物と高分子の溶解する含水アセトンを用いる点に特徴がある。しかしこの方法では用いることの可能な薬物と高分子に限界がある。



(7)エノラーゼを用いたマラリアワクチン開発の現況:
マラリアの疫学調査資料を精査してゆくと不思議なことにマラリアによる死亡者の多くは「流行地の乳幼児」と「日本人など非流行地からの渡航者」であることに気がつく。一方「流行地の大人」はマラリアに感染しても回復しやすい。これは、流行地の住民は「絶えずマラリアに感染することでマラリアへの免疫を獲得、維持している」ためと考えられる。従ってワクチン開発には、免疫状態の個人差を考慮しなくてはいけないことが明らかである。



この疫学研究の過程で、本発明者の鈴木と狩野は、南米と東南アジアの流行地の野外調査から、急性期の熱帯熱マラリア患者が病態の回復に関与する共通の抗原分子として、原虫由来の解糖系酵素・エノラーゼを発見した (非特許文献17)。すなわち、ヒトに感染した熱帯熱マラリア原虫が産生する解糖系酵素、エノラーゼが熱帯熱マラリアへの防御免疫分子として働いていることを見出し、これを利用したワクチン開発を開始した。



エノラーゼによるワクチン抗原は、原虫のエネルギー産生系を直接阻害して、原虫の増殖を抑制する点で、他に全く例がなく、大きく差別化されている。



先ず、発明者らは熱帯熱マラリア原虫由来のアミノ酸配列を有する組み換え型エノラーゼおよび部分アミノ酸配列を用いた人工抗原ペプチドの分子設計と化学合成の研究を行った。これらのエノラーゼおよび人工抗原ペプチドを用いた免疫学的な研究により、抗エノラーゼ抗体や抗ペプチド抗体は熱帯熱マラリア原虫のin vitroでの増殖を抑制することが明らかとなった(特許文献2)。



続いて熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼおよび部分配列による人工抗原ペプチドを用いて、ヨザル13頭によるワクチン試験を行った(図2)。ヨザル末梢血における、赤血球へのマラリア原虫の寄生率の推移をプロットした。その結果、ワクチンを投与したヨザルは寄生率の急激な上昇が抑えられており、ワクチンとしての効果に優れていることが明らかとなった(日本経済新聞、産経新聞、河北新報、中国新聞、4紙への掲載記事2003/8/25付)。また、血清中には抗エノラーゼ抗体や抗ペプチド抗体の産生していることも明らかとなった。



化学合成の観点から、ワクチン分子の合成法についても研究を進め、大量合成法に適したフラグメント縮合法の開発に成功した(特許文献3)。即ち、5つの短鎖ペプチドセグメントを縮合し1本の保護ペプチド鎖とすることにより、目的とするマラリア原虫エノラーゼの部分配列を持つペプチドまたはその類似体の合成を大規模に行う方法を見出した。



合成法の開発によって、実験室レベルの小スケールで行っても、約50~500ミリグラム(ワクチンとして約1千~1万人分)を一度に得ることができるようになった。実験室規模の合成をわずか2~4回行うだけで、工業的に世界最大級の遺伝子組換体の生産設備で行うのと同じ規模のペプチドを得ることが可能である。さらに工業スケールで生産が実施
されれば、年間の世界的需要に匹敵する数百万人分のペプチド供給が十分期待されている。



一般にタンパク質の部分アミノ酸配列を利用した化学合成ペプチドや遺伝子組み換え型ペプチドは人工抗原を始めとして医薬品や検査材料として様々な利用法が考えられる。これらの部分ペプチドを利用する際の問題点は、有機溶媒や水系溶媒に難溶な化合物の多いことにある。特に蒸留水や揮発性有機溶媒溶液(酢酸エチルやジエチルエーテルやジクロロメタンなど)へのペプチドやタンパク質の溶解性は非常に低い場合が多い。



発明者らのエノラーゼ部分配列に於いても同様に、蒸留水や揮発性有機溶媒溶液(酢酸エチルやジエチルエーテルやジクロロメタンなど)への溶解性は低い。よって既知の方法では、化学合成や遺伝子組み換えによってエノラーゼ部分配列の人工抗原が得られても、ダブルエマルジョン法やシングルエマルジョン法によって高分子微粒子に内包させることは困難があった。

産業上の利用分野


本発明は、新規な微粒子およびその製造方法に関する。本発明はまたヒトおよび他の動物での免疫反応を利用したマラリア原虫に対する免疫学的応答を誘発することができるペプチドおよびその類似体を含んだ微粒子、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の増殖を抑える免疫用抗原やマラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
マラリア原虫由来のペプチドと生分解性高分子を含む微粒子であって、マラリア原虫由来のペプチド酢酸および/または蟻酸の溶液を用いたシングルエマルジョン法によって作製された微粒子。

【請求項2】
前記生分解性高分子がポリ乳酸-グリコール酸共重合体である、請求項1に記載の微粒子。

【請求項3】
前記生分解性高分子がポリ乳酸である、請求項に記載の微粒子。

【請求項4】
前記生分解性高分子がポリデプシペプチドである、請求項に記載の微粒子。

【請求項5】
前記熱帯熱マラリア原虫由来ペプチドが熱帯熱マラリア原虫由来のエノラーゼまたはその部分ペプチドである、請求項1~4のいずれか一項に記載の微粒子。

【請求項6】
前記部分ペプチドが配列番号1と配列番号2との構造的差違部分を含み、熱帯熱マラリア原虫に対する細胞性または体液性の免疫学的応答を誘発しうるペプチドである、請求項に記載の微粒子。

【請求項7】
前記部分ペプチドが、配列番号3~6のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項に記載の微粒子。

【請求項8】
請求項1~のいずれか1項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。

【請求項9】
請求項のいずれか1項に記載の微粒子と、医薬的に許容可能な担体を含む、マラリア原虫感染症の予防のための医薬組成物。

【請求項10】
請求項のいずれか1項に記載の微粒子を有効成分として含有する、マラリア原虫の増殖を抑えるための免疫用抗原。

【請求項11】
マラリア原虫由来のペプチド酢酸および/または蟻酸溶液を、生分解性高分子を含む揮発性有機溶媒と混合する工程、及び該混合液を負電荷を有するポリマーの水溶液と混合する工程を含む、マラリア原虫由来ペプチド含有微粒子の製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2009059789thum.jpg
出願権利状態 登録
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