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D-セリンデヒドラターゼ及びその利用 UPDATE コモンズ 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P09S000373
整理番号 NU-0130
掲載日 2010年3月12日
出願番号 特願2008-539830
登録番号 特許第5218949号
出願日 平成19年10月16日(2007.10.16)
登録日 平成25年3月15日(2013.3.15)
国際出願番号 JP2007070193
国際公開番号 WO2008047802
国際出願日 平成19年10月16日(2007.10.16)
国際公開日 平成20年4月24日(2008.4.24)
優先権データ
  • 特願2006-283398 (2006.10.18) JP
発明者
  • 吉村 徹
  • 伊藤 智和
出願人
  • 国立大学法人名古屋大学
発明の名称 D-セリンデヒドラターゼ及びその利用 UPDATE コモンズ 実績あり 外国出願あり
発明の概要 現行のD-セリン定量法における様々な問題を解消する新規なD-セリン定量法を提供すること。また、D-セリン定量法に利用される新規な酵素、それをコードする遺伝子などを提供すること。(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有し、D-セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質からなる新規なD-セリンデヒドラターゼが提供される。また、当該酵素を試料に反応させた後、生じたアンモニア又はピルビン酸を定量し、定量値から試料中のD-セリン量を算出することを特徴とするD-セリン定量法が提供される。
従来技術、競合技術の概要


アミノ酸にはL体とD体という二つの鏡像異性体が存在する。L-アミノ酸についてはタンパク質を構成するという重要な役割を果たすことに加え、生体内において様々な生理活性を発揮することが知られている。一方のD-アミノ酸は細胞壁の構成成分として細菌の生育に必須であることは以前より知られていたものの、真核生物におけるその役割は不明であった。最近になって、D-アミノ酸が真核生物においても重要な生理作用を有することが分かってきた。D-アミノ酸の中でもD-セリンについては、哺乳動物の脳に遊離状態で存在し、NMDA受容体のコアゴニストとして作用すること(非特許文献1)、統合失調症患者の脳脊髄液又は血清ではD-セリン含量が有意に低下しているとともに全セリン含量に占めるD-セリン含量の割合(D-セリン含量/全セリン含量)も有意に低下していること(非特許文献2、3)、さらにはアルツハイマー病患者の血清では全セリン含量に占めるD-セリン含量の割合(D-セリン含量/全セリン含量)が有意に低下していること(非特許文献4)等が報告されており、特に神経疾患との関係が注目されている。このように今後の応用が期待されるD-セリンであるが、簡便な定量法が存在しないのが現状である。酵素を利用したD-セリンの定量法は実用化されておらず、専ら、蛍光試薬等で標識した後にHPLCやキャピラリー電気泳動を用いて定量する方法、又は誘導体化した後にガスクロマトグラフィー(GC)を用いて定量する方法によってセリンの定量が行われている(非特許文献5)。
【非特許文献1】
Lesson, P.D., and Iverson, L.L.(1994) J. Med. Chem. 37, 4053-4067.
【非特許文献2】
Hashimoto et al. (2003) Arch. Gen. Psychiatry 60, 572
【非特許文献3】
Hashimoto et al. (2005) Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 29, 767
【非特許文献4】
Hashimoto et al. (2004) Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 28, 385-8.
【非特許文献5】
Sensitive Determination of D-Amino Acids in Mammals and the Effect of D-Amino-Acid Oxidase Activity on Their Amounts. Biological & Pharmaceutical Bulletin. (2005), 28, 1578
【非特許文献6】
Characterization of the catalytic pathway for D-serine dehydratase. Evidence for variation of the rate-determining step with substrate structure. J Biol Chem. (1983) 258(9):5379-5385.
【非特許文献7】
D-serine dehydratase acting also on L-serine from Klebsiella pneumoniae. J Biochem . 1978 Nov;84(5):1133-1138.

産業上の利用分野


本発明はD-セリンデヒドラターゼに関する。詳しくは、本発明は真核生物由来のD-セリンデヒドラターゼ及びその用途に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、全アミノ酸の1%未満に相当する数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、D-セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質、からなるD-セリンデヒドラターゼを含むD-セリン定量用試薬。

【請求項2】
前記D-セリンデヒドラターゼがL-セリンには反応しないことを特徴とする、請求項1に記載のD-セリン定量用試薬。

【請求項3】
前記D-セリンデヒドラターゼは、D-セリンに対する反応性を100%としたときのD-スレオニンに対する反応性が5%以下である、請求項1又は2に記載のD-セリン定量用試薬。

【請求項4】
前記D-セリンデヒドラターゼが大腸菌を宿主として発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載のD-セリン定量用試薬。

【請求項5】
請求項1~4のいずれか一項に記載のD-セリン定量用試薬と、使用説明書とを含む、D-セリン定量用キット。

【請求項6】
以下のステップを含む、D-セリン定量法:
(1)生体から調製された試料又は非生体由来の試料を用意するステップ;
(2)(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、全アミノ酸の1%未満に相当する数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、D-セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質、からなるD-セリンデヒドラターゼを前記試料に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD-セリン量を算出するステップ。

【請求項7】
以下のステップを更に含む、請求項6に記載のD-セリン定量法:
(5)アミノ酸ラセマーゼをステップ(2)後の反応液に添加し、前記D-セリンデヒドラターゼの共存下で反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値と、(4)で算出したD-セリン量より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。

【請求項8】
以下のステップを含む、D-セリン定量法:
(1)生体から調製された試料又は非生体由来の試料を用意するステップ;
(2)(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、全アミノ酸の1%未満に相当する数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、D-セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質、からなるD-セリンデヒドラターゼを前記試料の一部に添加し、反応させるステップ;
(3)(2)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(4)(3)で得た定量値より、前記試料中のD-セリン量を算出するステップ;
(5)(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなりタンパク質、又は(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、全アミノ酸の1%未満に相当する数のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/又は挿入されてなるアミノ酸配列からなり、D-セリンデヒドラターゼ活性をもつタンパク質、からなるD-セリンデヒドラターゼとアミノ酸ラセマーゼとを、前記試料の他の一部に添加し、反応させるステップ;
(6)(5)の結果生じたアンモニア又はピルビン酸を定量するステップ;
(7)(6)で得た定量値より、前記試料中の全セリン量を算出するステップ。

【請求項9】
前記D-セリンデヒドラターゼがL-セリンには反応しないことを特徴とする、請求項6~8のいずれか一項に記載のD-セリン定量法。

【請求項10】
前記D-セリンデヒドラターゼは、D-セリンに対する反応性を100%としたときのD-スレオニンに対する反応性が5%以下である、請求項6~9のいずれか一項に記載のD-セリン定量法。

【請求項11】
前記D-セリンデヒドラターゼが大腸菌を宿主として発現させた組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項6~10のいずれか一項に記載のD-セリン定量法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
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出願権利状態 登録
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