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GENE-DEFICIENT BACTERIUM STRAIN NOT TRANSGENIC AND HAVING NO EXOGENOUS GENE INTRODUCED, METHOD OF PRODUCTION AND SELECTION THEREOF

Patent code P10A015372
Posted date Apr 9, 2010
Application number P2008-226016
Publication number P2010-057406A
Patent number P5783503
Date of filing Sep 3, 2008
Date of publication of application Mar 18, 2010
Date of registration Jul 31, 2015
Inventor
  • (In Japanese)井上 康宏
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title GENE-DEFICIENT BACTERIUM STRAIN NOT TRANSGENIC AND HAVING NO EXOGENOUS GENE INTRODUCED, METHOD OF PRODUCTION AND SELECTION THEREOF
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of making gene-deficient bacterium strain without using exogenous gene.
SOLUTION: The gene-deficient bacterium strain is made by homologous recombination using circularized DNA comprising DNA present in an upstream region and downstream region of the gene to be made deficient, without using any exogenous gene. The method of production and selection thereof are also provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年、様々な植物病原性細菌の病原性関連遺伝子が同定されている。その病原性関連遺伝子を分子生物学的手法により破壊した遺伝子破壊株が多数作製されている。これまでに病原性を喪失した細菌を施用することによって当該病害を防除できることが報告されており(非特許文献1)、病原性関連遺伝子を破壊して作製した病原性喪失株でもこのような能力を付加できることが期待される。



従来的に病原性関連遺伝子の破壊株は、外来遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子や、栄養素の利用性に関する遺伝子など)をマーカー遺伝子として、遺伝子組換え技術により病原性関連遺伝子に挿入または置換することによって作製される(非特許文献2,3,4)。また、従来の遺伝子破壊株はマーカーとして挿入された遺伝子の選択性を利用して選抜される。



【非特許文献1】
日本植物病理学会報56:243-246(1990)
【非特許文献2】
山田雅巳(2003)バクテリアにおける遺伝子破壊株の作成方法.Environ. Mutagen Res. 25:87-92
【非特許文献3】
S. Kamoun, E. Tola, H. Kamdar C. I. Kado (1992) Rapid generation of directed and unmarked deletions in Xanthomonas. Mol. Microbiol. 6: 809-816
【非特許文献4】
K. A. Datsenko, B. L. Wanner (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS 97:6640-6645

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、欠損させたい遺伝子の上流領域および下流領域のDNAからなる環状化DNAを用いた相同組換えにより、外来遺伝子を用いることなく作製される遺伝子欠損株とその作製および選抜方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
外来遺伝子を使用しない遺伝子欠損細菌株の作製方法であって、以下の工程:
(a)欠損させたい遺伝子の上流領域および下流領域のDNAをPCRによって増幅するステップ;
(b)得られた上流領域および下流領域のDNA断片を連結させ、上流領域および下流領域の連結DNA断片を得て、それを環状化するステップ;
(c)得られた環状化DNAをXanthomonas属に属する植物病原細菌に導入し、該細菌のDNAと相同組換えを行うステップ;および
(d)宿主細菌のDNA上における相同組換え部位の外側に設計されたプライマーを少なくとも1つ用いて1st PCRを行うことを含む、Nested-PCRによって遺伝子欠損細菌株のスクリーニングを行うステップ、
を含む、上記方法。

【請求項2】
 
病原性関連遺伝子の欠損細菌株を作製するための、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
上流領域および下流領域のDNA断片を結合PCRによって連結する、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
上流領域および下流領域の連結DNA断片をセルフライゲーションにより環状化する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
1st PCRにて用いられるプライマーが全て相同組換え部位の外側に設計されたプライマーである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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25284_01SUM.gif
State of application right Registered


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