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METHOD FOR AMPLIFYING DNA

Patent code P10A015475
Posted date Jun 4, 2010
Application number P2008-268841
Publication number P2010-094091A
Patent number P5652843
Date of filing Oct 17, 2008
Date of publication of application Apr 30, 2010
Date of registration Nov 28, 2014
Inventor
  • (In Japanese)高橋 宏和
  • (In Japanese)杉山 滋
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title METHOD FOR AMPLIFYING DNA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently amplifying a DNA, especially the method by which the DNA can specifically efficiently be amplified by an MDA method even when a linear DNA is used as a template or even when the amount of the template DNA is trace.
SOLUTION: The method for amplifying the DNA is carried out by a chain-substitution type DNA-synthesizing reaction in a reaction liquid composition in which an electrolyte providing a monovalent and/or divalent cation and an anion is dissolved, wherein, the anion is the one except a chloride ion, not exerting inhibitory action on the chain-substitution type DNA synthesizing reaction, and a template DNA, a primer and a chain-substitution type synthetic enzyme are reacted in the reaction liquid composition. The reaction liquid composition, the primer and the kit, used for the method are also provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


遺伝子解析は、病態の解明や新規有用遺伝子の探索などに有用な大量の生物学的情報を入手し得る方法であり、現在の医学および生物学にとって最も重要な手法となっている。しかし、医療、犯罪捜査、研究、産業などの分野においては、臨床における生体採取材料、法医学材料、絶滅危惧種、または培養方法が確定していない微生物など、得られるDNA量が限られている場合が頻繁にある。そして、多くの場合、遺伝子解析に必要とされるDNA量は、得られるDNA量に比べてかなり多い。そのため、得られたDNA全体をまんべんなく増幅(全ゲノム増幅)することが、これまでに数多く試みられてきた。



DNAの増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction:PCR)法が有名であり、このPCR法を基盤とした様々な全ゲノム増幅方法が考え出され、広く使用されてきた。しかし、PCRを基盤とした従来の方法には、(1)増幅されるDNAの長さが比較的短い(平均1kbp程度)、(2)DNAの網羅率に偏りが出る、(3)繰り返し配列が増幅され易い、(4)鋳型となったDNA以外の非特異産物が増幅されるなど、増幅以降の解析方法や使用方法に制限や解析結果の偏りがもたらされることがわかってきた。



近年、鎖置換型DNA合成酵素とランダムプライマーとを用いたDNA増幅方法であるマルチプルディスプレースメント増幅(MDA)法(図1)が開発された(非特許文献1)。この方法によれば、PCRをベースとして開発された増幅法の諸問題のうち、(1)増幅されるDNAの長さが比較的短いこと、(2)DNAの網羅率に偏りが出ること、および(3)繰り返し配列が増幅され易いことが改善されており、現在では全ゲノム増幅方法の主流となっている。



また、特に鋳型DNAが少量の場合、上記問題点(4)の克服は依然として困難であったが、RNAプライマーを利用することにより、鋳型が環状DNAであれば、疑似増幅産物を抑制することが可能となった(特許文献1)。しかしながら、この環状DNA増幅の反応条件では、直鎖状DNAの増幅効率および増幅配列の忠実度が低下するという問題があった。



またMDA法では、一般に鋳型DNAが微量の場合、プライマーダイマー由来と思われる非特異的DNA増幅が過剰に起こり、その結果、目的のDNAが合成されず、増幅後のDNAの組成がオリジナル(鋳型DNAのソース)のDNAとは異なるものとなり、増幅後の解析、例えば配列決定時に、誤った結果を生じるという問題点があった。従って、MDA法は、現時点では、再入手が困難な生体サンプルおよびフィールドサンプルなど希少なDNAの増幅には用いることができなかった。



MDA法の増幅効率の改善は、これまでに主に反応時間の増加により行われていたが、原理的に限界点が存在する。MDA法の効率は鋳型の長さにある程度依存するが、1~10分子(コピー)のDNAから増幅することは不可能である。これは、環状DNAを鋳型として繰り返し使用するマルチプリープライムローリングサークル増幅(MPRCA)法(非特許文献2)とは異なり、MDA法において直鎖状DNAを鋳型として用いる場合は初期鋳型を再利用できないためである。



図1は、MDA法におけるDNA増幅の模式図である。(1)変性した一本鎖DNAにランダムにプライマーがアニールする。(2)アニールしたプライマーからDNA合成が開始され、合成方向に存在する他のプライマーによって先に合成されている相補鎖DNAを鋳型DNA鎖からはがしながら、DNA合成が続く。また、剥がされたDNA鎖にも新たにプライマーがアニールする。(3)剥がされたDNA鎖にアニールしたプライマーからもDNA合成が行われ、これら一連の反応が連鎖的に起きる。初期鋳型は最も3’末端からの合成が終了した後、二度と使用されることはない。これは剥がされたDNA鎖でも同様である。



DNA合成における増幅効率は、反応初期に使用されるプライマーの数に大きく依存するため、アニール効率の低い短いプライマーの場合には、より多量のプライマーを利用する必要がある。反応初期において十分な量のプライマーがアニールするためには、初期鋳型の長さが少なくとも50 kbp以上であることが要求され、さらに鋳型が長ければ長いほど増幅効率は上昇する。しかしながら、物理的に扱えるDNAの長さはほぼ500 kbp~1 Mbp程度であり、それ以上の長さではピペットで扱う際に物理的に非常に切断されやすく、実際に鋳型に用いることは不可能であった。
【特許文献1】
特開2006-141357号公報
【非特許文献1】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2002年、第99巻、p5261-5266
【非特許文献2】
Genome Research、2001年、第11巻、p.1095-1099

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、鋳型核酸からのDNA複製およびさらなるDNA増幅に有用な新規の組成物および方法に関する。本発明は、具体的には、鎖置換型DNA合成酵素を利用するDNA増幅方法、例えばマルチプルディスプレースメント増幅法(multiple displacement amplification:MDA)およびマルチプリープライムローリングサークル増幅法(mulitiply-primed rolling circle amplification:MPRCA)に有用な新規の反応液組成物および方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
一価および/または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる反応液組成物中での、phi29 DNAポリメラーゼを用いる鎖置換型DNA合成反応によるDNA増幅方法であって、
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される1または2以上の陰イオンであって、前記鎖置換型DNA合成反応に阻害作用を及ぼさない濃度で提供され、
前記鎖置換型DNA合成反応に配列の全てまたは一部にRNAを含むプライマーを用い、
前記RNAプライマーと新規に合成されたDNAとの間にRNase Hによりニックを形成する反応を含む、前記DNA増幅方法。

【請求項2】
 
DNA増幅方法が、マルチプリープライムローリングサークル増幅法(MPRCA)、またはマルチプルディスプレースメント増幅法(MDA)である、請求項1に記載のDNA増幅方法。

【請求項3】
 
鋳型DNAが直鎖状である、請求項1または2に記載のDNA増幅方法。

【請求項4】
 
DNA合成反応とニック形成反応とを同時に行う、請求項1~3のいずれか一項に記載のDNA増幅方法。

【請求項5】
 
一価および/または二価の陽イオンと陰イオンとを提供する電解質が溶解されてなる、請求項1~4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法に用いるための反応液組成物であって、
前記陰イオンが、グルタミン酸イオン、アスパラギン酸イオンおよび酢酸イオンから選択される1または2以上の陰イオンである、前記反応液組成物。

【請求項6】
 
一価および/または二価の陽イオンの濃度が5 mM以上である、請求項5に記載の反応液組成物。

【請求項7】
 
一価および二価の陽イオンを含み、該一価および二価の陽イオンがそれぞれ異なる陰イオンと対形成している、請求項5または6に記載の反応液組成物。

【請求項8】
 
陽イオンが、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、およびマンガンイオンからなる群より選択される1または2以上を含む、請求項57のいずれか一項に記載の反応液組成物。

【請求項9】
 
鎖置換型DNA合成酵素およびRNase Hの双方の活性を促進する、請求項58のいずれか一項に記載の反応液組成物。

【請求項10】
 
pH調製剤をさらに含み、該pH調製剤が塩化物イオンを含まない、請求項59のいずれか一項に記載の反応液組成物。

【請求項11】
 
請求項1~4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法に用いるRNAプライマーであって、塩基の全てまたは一部がチオリン酸エステル結合により結合されている、前記プライマー。

【請求項12】
 
5’末端から少なくとも1塩基がRNAである、請求項11に記載のプライマー。

【請求項13】
 
3’末端から少なくとも3塩基が非修飾RNA塩基である、請求項11または12に記載のプライマー。

【請求項14】
 
5’末端から少なくとも1塩基が非修飾RNAまたは修飾RNA塩基である、請求項13に記載のプライマー。

【請求項15】
 
ランダムプライマーである、請求項1114のいずれか一項に記載のプライマー。

【請求項16】
 
請求項1~4のいずれか一項に記載のDNA増幅方法のためのキットであって、
請求項510のいずれか一項に記載の組成物、および/または
請求項1115のいずれか一項に記載のプライマー
を含む、前記キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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25989_01SUM.gif
State of application right Registered


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