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VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-BINDING APTAMER meetings

Patent code P10A015496
Posted date Jun 11, 2010
Application number P2007-078642
Publication number P2008-237042A
Patent number P5223086
Date of filing Mar 26, 2007
Date of publication of application Oct 9, 2008
Date of registration Mar 22, 2013
Inventor
  • (In Japanese)池袋 一典
  • (In Japanese)早出 広司
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京農工大学
Title VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-BINDING APTAMER meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new aptamer having a high binding ability to a vascular endothelial growth factor.
SOLUTION: This new method for creating the new aptamer comprises combining a well-known method for using a carrier in which both a target substance and a non-target substance are immobilized with a gel-shift method for separating a complex of the target substance bound in a solution with a polynucleotide according to gel electrophoresis and collecting the complex, and is freely used as a screening step in the method for creating the aptamer to thereby succeed in obtaining the aptamer having the high binding ability to the vascular endothelial growth factor. As a result, the base sequence is determined and a plurality of deletion mutants thereof are further synthesized to study the binding ability thereof to the vascular endothelial growth factor. The site of interaction with the vascular endothelial growth factor is found out.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


VEGFは、血管の内皮細胞に存在する受容体に結合し、内皮細胞の増殖を促すことで、血管新生を促進する。このためVEGFは、血管新生が重要な役割を果たす各種疾患との関連が注目されており、例えば、固形腫瘍患者の血清中での濃度上昇が報告されている。このため、VEGFに結合する物質が得られれば、血管新生を伴うさまざまな疾患の診断を行ううえで有用なセンサー素子となることが期待される。



試料中のタンパク質等の被検物質の測定は、現在、主として免疫測定法により行なわれている。免疫測定法としては様々な方法が知られており、実用化されているが、いずれの方法においても、被検物質に対する特異抗体が用いられる。被検物質に対する特異抗体の作出は常法により行なうことができるが、手間がかかり、このため特異抗体は高価である。



一方、任意の分子と特異的に結合するポリヌクレオチド分子であるアプタマーが知られている。アプタマーは、市販の核酸合成機を用いて化学的に全合成できるので、特異抗体に比べてはるかに安価であり、修飾が容易であるため、センシング素子としての応用が期待されている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献1)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を10回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。



また、本願発明者らは、通常のSELEXにおいて、被検物質との結合能がより高いアプタマーを効率的に得ることができるSELEXの改良法を発明した(特許文献1)。特許文献1に記載されるSELEX改良法では、通常のSELEXにおいて、所望の標的物質と核酸ライブラリー中の核酸とを結合させる際に、非標的物質を固定化した担体を共存させ、所望の標的物質と結合した核酸のみを回収し、PCRにより増幅し、増幅物から一本鎖核酸を取得し、これを核酸ライブラリーとして、標的物質を固定化した領域に接触させ、固相に結合した核酸を回収し、同様にPCRで増幅し、一本鎖を取得し、これを核酸ライブラリーとして再度、標的物質と非標的物質をそれぞれ固定化した領域と接触させ、以下同様にサイクルを繰り返す方法である。この方法によれば、非標的物質や担体に結合するアプタマーは淘汰され、標的物質に特異的に結合するアプタマーが濃縮されていく。



上記の通り、アプタマー自体及びその創製方法は公知であるが、VEGFに結合するアプタマーは知られていない。また、上記の通り、アプタマーの創製方法は、偶然を積極的に利用する方法であるので、標的物質に対して高い結合能を有するアプタマーが得られるかどうかはやってみなければわからない。



【特許文献1】
特開2007-14292号公報
【非特許文献1】
Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor、以下、「VEGF」と呼ぶことがある)に結合する新規なアプタマーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号1又は配列番号2記載の塩基配列から成る一本鎖ポリヌクレオチド。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2007078642thum.jpg
State of application right Registered
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