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NON-DIFFUSING PLANT VIRUS VECTOR

Patent code P10A015513
File No. P2008-068-JP01
Posted date Jun 18, 2010
Application number P2008-206446
Publication number P2010-041932A
Patent number P5487463
Date of filing Aug 8, 2008
Date of publication of application Feb 25, 2010
Date of registration Mar 7, 2014
Inventor
  • (In Japanese)福澤 徳穂
  • (In Japanese)松村 健
  • (In Japanese)一町田 紀子
  • (In Japanese)石原 岳明
  • (In Japanese)増田 税
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人産業技術総合研究所
  • (In Japanese)ホクレン農業協同組合連合会
  • (In Japanese)国立大学法人北海道大学
Title NON-DIFFUSING PLANT VIRUS VECTOR
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a non-diffusing plant virus vector, to provide a selective/specific expression system for the plant virus vector, and to provide an expression method therefor.
SOLUTION: Provided are the selective/specific expression system for the plant virus vector, obtained by combining a non-diffusing plant virus vector omitting a gene pertaining to intercellular migration in the cucumber mosaic virus (CMV) genome with a transformed plant into which the omitted intercellular migration gene has been transduced, and establishing the selective/specific infection and proliferation of the non-diffusing plant virus vector in the transformed plant; and the expression method therefore. Provided are the new non-diffusing plant virus vector that enables viral vector infection and proliferation only in recombinant plants into which genes necessary for viral proliferation have been transduced and with which unintended recombinant viral diffusion can be avoided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


従来、植物RNAウイルスベクターの研究は、感染植物における増殖能が非常に高いタバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus,TMV)とブロモモザイクウイルス(Bromo mosaic virus,BMV)の感染性クローンを用いて行われてきた。そして、この分野では、ウイルス遺伝子の発現様式の違いなどから、今までに、いくつかの外来遺伝子の発現方式が開発されている。



ここで、それらを紹介すると、例えば、TMVやポティウイルス属(Potyvirus)では、ウイルスCP遺伝子と外来遺伝子が融合したタンパク質を発現するベクターが開発されている(非特許文献1~2参照)。また、TMVと近縁のウイルス(Odontoglossum ringspot virus)のサブゲノミックプロモーターを導入することにより、サブゲノムを介して外来遺伝子を発現させるベクターも開発されている(非特許文献3参照)。



ただ、これまでは、このようなウイルスベクターの開発には、主にTMVやポティウイルス属に代表される、棒状、ひも状のウイルスが使用されてきた。それは、棒状、ひも状のウイルスベクターは、球状ウイルスに比べ、挿入できる外来遺伝子の長さに物理的制限が少ないという利点があるからである。一方、球状ウイルスであるBMVにおける発現ベクターの系としては、1aタンパク質、2aタンパク質の複製酵素遺伝子を発現するタバコに、外来遺伝子をもつRNA3を接種するという方法が報告されている(非特許文献4参照)。



また、CMVにおいても、ウイルスベクターについて、幾つかの研究がなされている。その一つは、complementation による4分節CMVベクターの開発である(非特許文献5参照)。CMVのRNA3にはMPとCPがコードされており、ウイルスの細胞間移行にはMPとCPの両方が必須である(非特許文献5参照)。



そこで、これまでに、本発明者らは、RNA3分子を改変し、MP領域をGFP遺伝子に置換したRNA3AとCP遺伝子を持たないRNA3Bを構築し、complementation により細胞間移行するウイルスベクターを開発した。これを、RNA1、RNA2、RNA3A、及びRNA3Bの4分節のウイルスゲノムを持つCMVとして、ベンタミアーナに接種したところ、接種葉のminor veinでGFP蛍光が観察された。



また、RNA3Bで欠失させたCP領域にマルチクローニングサイトを挿入し、そこに、GUS(bacterial-β-glucuronidase)遺伝子やBYMV(Bean yellow mosaic virus)のCP遺伝子を導入したところ、接種葉のminor veinにおいて、GUS活性やBYMV-CPが検出された。しかし、このRNA3A、RNA3Bが、互いにhomologous RNA recombinationを起こし、上葉では、導入遺伝子の発現は見られなかった。



その他に、先行技術として、種々の異なった宿主植物に適用可能なキュウリモザイクウイルスベクターで各種タンパク質を生産すること等、各種の関連技術が開発されている(非特許文献7~11)。



【非特許文献1】
Sugiyama,Y.,Hamamoto,H.,Takemoto,S.,Watanabe,Y.and Okada,Y.,Systemic production of foreign peptides on the particle surface of Tobacco mosaic virus,FEBS Letters 359,247-250(1995)
【非特許文献2】
Fernandez-Fernandez,M.R.,Martinez-Torrecuadrada,J.L.,Casal,J.I.and Garcia,J.A.,Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus,FEBS Letters 427,229-235(1998)
【非特許文献3】
Donson et al.,Systemic expression of a bacterial gene by a tabacco mosaic virus-based vector,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7204-7208(1991)
【非特許文献4】
Mori,M.,Kaido,M.,Okuno,T.and Furusawa,I.,mRNA amplification system by viral replicase in transgenic plants,FEBS Lett.336,171-174(1993)
【非特許文献5】
Zhao,Y,,Hammond,J.Tousignant,M.E.and Hammond,R.W.,Development and evaluation of a complementation-dependent gene delivery system based on Cucumber mosaic virus, Archives of Virology 145,2285-2295(2000)
【非特許文献6】
Canto,T.,Prior,D.A.,Hellward K.H.,Oparka,K.J.,Palukaitis,P.,Characterization of cucumber mosaic virus.IV.Movement protein and coat protein are both essential for cell-to-cell movement of cucumber mosaic virus,Virology 237,237-248(1997)
【非特許文献7】
Matsuo,K,Hong,JS,Tabayashi,N,Ito,A,Masuta,C,Matsumura,T.Development of Cucumber mosaic virus as a vector modifiable for different host species to produce therapeutic proteins.Planta(2007)225:277-286
【非特許文献8】
Baulcombe,DC,Chapman,S,Santa Cruz,S.Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections.Plant J(1995)7:1045-1053
【非特許文献9】
Wang,ZD,Ueda,S,Uyeda,I,Yagihashi,H,Sekiguchi,H,Tacahashi,Y,Sato,M,Ohya,K,Sugimoto,C,Matsumura,T.Positional effect of gene insertion on genetic stability of a clover yellow vein virus-based expression vector.J Gen Plant Pathol(2003)69:327-334
【非特許文献10】
Mitsuhara,I,Ugaki,M,Hirochika,H,Ohshima,M,Murakami,T,Gotoh,Y,Katayose,Y,Nakamura,S,Honkura,R,Nishimiya,S,Ueno,K,Mochizuki,A,Tanimoto,H,Tsugawa,H,Otsuki,Y,Ohashi,Y.Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants.Plant Cell Physiol(1996)37:49-59
【非特許文献11】
Murashige,T,Skoog,F.A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiol Plantarum(1962):15473-15497

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、非拡散植物ウイルスベクターに関するものであり、更に詳しくは、ウイルスの植物体の細胞間移行に関する遺伝子を欠落させた植物ウイルスベクターと、別に植物体への細胞間移行に必要なタンパク質遺伝子を植物体に導入することにより、通常の植物に接種しても増殖できないが、上記細胞間移行に必要なタンパクを発現する植物体でのみ増殖可能な非拡散ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法に関するものである。本発明は、土壌伝染、昆虫媒介、接触伝播等の無秩序なウイルスベクターの拡散が起きないようにした非拡散植物ウイルスベクター、植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システム及びその発現方法を提供するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターであって、上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有し、上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる作用を有することを特徴とする植物ウイルスベクター。

【請求項2】
 
キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターの上記形質転換植物体に対する選択的・特異的感染及び増殖を成立させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現システムであって、
上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有するベクターであり
上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。

【請求項3】
 
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項2に記載の植物ウイルスベクター選択的・特異的発現システム。

【請求項4】
 
キュウリモザイクウイルス(CMV)ゲノムの細胞間移行に係る遺伝子を欠落させた非拡散植物ウイルスベクターと、欠落させた当該細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換植物体とを組み合わせて、上記非拡散植物ウイルスベクターを、上記形質転換植物体に対して選択的・特異的に感染及び増殖させる植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法であって、
上記植物ウイルスベクターが、CMVの植物体での細胞間移行に必要な3aタンパク質をコードするRNA3上の3a遺伝子を終止コドン置換により欠落させた、3aタンパク質を発現しないCMVベクターであるとともに、植物体に発現させるべき外来遺伝子をRNA2遺伝子内に有するベクターであり
上記形質転換植物が、上記RNA3遺伝子を導入した形質転換体であることを特徴とする植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。

【請求項5】
 
上記細胞間移行に係る遺伝子を導入した形質転換体が、上記細胞間移行に係る遺伝子を外来遺伝子として挿入した組換えベクターを導入した形質転換体である、請求項4に記載の植物ウイルスベクターの選択的・特異的発現方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2008206446thum.jpg
State of application right Registered
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