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ORDINARY TEMPERATURE TYPE ASPARTATE DEHYDROGENASE AND METHOD FOR PRODUCING L-ASPARTIC ACID meetings

Patent code P100000426
Posted date Dec 4, 2009
Application number P2009-029181
Publication number P2010-183860A
Patent number P5504514
Date of filing Feb 11, 2009
Date of publication of application Aug 26, 2010
Date of registration Mar 28, 2014
Inventor
  • (In Japanese)澤 嘉弘
  • (In Japanese)川上 矩加
  • (In Japanese)石川 孝博
  • (In Japanese)柴田 均
  • (In Japanese)芦田 裕之
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人島根大学
Title ORDINARY TEMPERATURE TYPE ASPARTATE DEHYDROGENASE AND METHOD FOR PRODUCING L-ASPARTIC ACID meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a stable aspartate dehydrogenase having high enzymatic activity at ordinary temperature.
SOLUTION: There is provided a protein represented by the following (A) or (B): (A) a protein having a specific sequence; or (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are replaced, deleted, inserted, added or inverted, and having aspartate dehydrogenase activity.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



L-アスパラギン酸はタンパク質を構成するアミノ酸のうちの一つであり、生体内できわめて有用なアミノ酸である。実際に、アスパラギン酸を含めて、アミノ酸はアミノ酸輸液などの医薬としても広く用いられている。また、アスパラギン酸に関しては、人工甘味料アスパルテームの原料素材としても広く活用されている。





アスパラギン酸をはじめ各種のアミノ酸は、ケト酸とアンモニアを触媒にアミノ酸脱水素酵素を用いた還元的アミノ化反応により得ることができる。アスパラギン酸の場合は、オキサロ酢酸が原料となる。





自然界に知られるアミノ酸脱水素酵素は、わずかに、アラニン脱水素酵素(AlaDH)、グルタミン酸脱水素酵素(GluDH)、ロイシン脱水素酵素(LeuDH)、バリン脱水素酵素(ValDH)、フェニルアラニン脱水素酵素(PheDH)であり、アスパラギン酸脱水素酵素(AspDH)も、近年ようやく発見されたものである。





一つは、古細菌アーキオグロブス・フルジダス由来のAspDH(特許文献1)であり、もう一つは本発明者らによるバシラス・ズブチリス由来であって変異させて活性を高めたAspDH(特許文献2)である。これらのAspDHを用いれば、L-アスパラギン酸を得ることが可能となる。なお、以降において前者を適宜AfAspDHと表記し、後者を適宜BsAspDHと表記する。





また、L-アスパラギン酸を工業的に得る方法としてアスパルターゼを用いた酵素法も知られている(特許文献3~特許文献6)。





しかしながら、従来の技術では以下の問題点があった。

AfAspDHは、安定性はきわめて高いが、酵素活性は高くなく、特に常温における還元活性が低いという問題点があった。ここで、オキサロ酢酸は高温で不安定であるため、反応系の温度を高めるには限界があるという原理的な問題点があった。また、BsAspDHについては、常温で比較的高い活性を示すが、安定性が低く、また、オキサロ酢酸以外にピルビン酸にも反応性を示すという問題点があった。





また、アスパルターゼを用いる特許文献3~特許文献6に開示される技術では大腸菌等を用いるため、菌中のフマラーゼによりL-リンゴ酸も生成されてしまう。このため、加熱によるフマラーゼ活性の除去操作を必要とするが、加熱処理によりアスパルターゼも一部失活や安定性の低下を招来してしまうという問題点があった。





また、本発明者らによる方法(特許文献2)では、上述のような加熱処理は不要であり、また、オキサロ酢酸より安価なDL-リンゴ酸を原料に用いるが、DL-リンゴ酸も比較的高価な原料であるという問題点があった。また、この方法でL-アスパラギン酸を得ることもできるが、同時にD-リンゴ酸も生成されるため、これを分離する後工程が必要となるという問題点があった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、常温で高い触媒活性を有するアスパラギン酸脱水素酵素およびこれを用いたL-アスパラギン酸製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
原料として、フマル酸およびアンモニウム塩、または、フマル酸アンモニウム、を供給し、
触媒として、フマラーゼ、Bacillus subtilis 由来リンゴ酸脱水素酵素、並びに、
下記1.若しくは2.に記載のアスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を加え、
酵素法によりL-アスパラギン酸を得ることを特徴とするL-アスパラギン酸製造方法。
1.
下記(A)又は(B)に示すタンパク質。
(A)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号2に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
2.
下記(C)又は(D)に示すタンパク質。
(C)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号4に記載のアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アスパラギン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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