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METHOD FOR QUANTIFYING METAL PROTOPORPHYRIN COMPLEX AND ENZYME SENSOR USED FOR THE SAME meetings

Patent code P100000445
File No. 9001
Posted date Dec 11, 2009
Application number P2009-129822
Publication number P2010-273610A
Patent number P5761660
Date of filing May 29, 2009
Date of publication of application Dec 9, 2010
Date of registration Jun 19, 2015
Inventor
  • (In Japanese)坂本 寛
  • (In Japanese)古賀 真也
  • (In Japanese)小松 英幸
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人九州工業大学
Title METHOD FOR QUANTIFYING METAL PROTOPORPHYRIN COMPLEX AND ENZYME SENSOR USED FOR THE SAME meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple and highly sensitive quantifying method and an enzyme sensor used for the method by improving the conventional method for quantifying a metal protoporphyrin complex containing hem.
SOLUTION: The method for quantifying the metal protoporphyrin complex comprises the use of, as a fluorescent dye, a hydrophilic fluorescent dye whose fluorescent wavelength overlaps with the absorption wavelength of the metal protoporphyrin complex and the enzyme sensor used for it in the method for quantifying a metal protoporphyrin complex using hem oxygenase fluorescence-labeled by a fluorescent dye. It is desirable that the hem oxygenase is a hem oxygenase in which the eighteenth residue of rat hem oxygenase is mutated to cysteine and, into the same position, a hydrophilic fluorescent dye with the fluorescence wavelength which overlaps with the absorption wavelength of the metal protoporphyrin complex is introduced.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


プロトポルフィリンは、ポルフィン環に4つのメチル基、2つのビニル基、2つのプロピォン酸基が結合したポルフィリンの総称であり、通常は、ヘムやクロロフィルの前駆体となる、下記化1の式で表わされるプロトポルフィリンIXを意味する。そして、金属とこのプロトポルフィリンとから構成される錯体が金属プロトポルフィリン錯体であり、金属が鉄原子(2価又は3価)の場合が、ヘモグロビン(ヘム蛋白)の構成成分として知られているヘムである。



【化1】




生体色素のヘムは、遊離状態で細胞内エフェクターとして働くことが近年明らかとなってきた。それに伴い、低濃度のヘムを高感度で定量するための技法に対するニーズが高まってきている。遊離ヘムは、幅広い吸収帯を有する一方で吸光率が小さい分子であるため、本来の吸光度測定による定量は、低濃度領域において不可能である。また、既存のヘム定量法は、煩雑な操作を有することや、低感度であること、また、夾雑物を多く含む試料の定量が困難であることなどの問題点がある。



これまで、具体的なヘムの定量には、主に、ピリジンヘモクロム法(非特許文献1と2参照)が用いられてきたが、有機溶媒による抽出操作が煩雑で、発色団の吸光係数も低く、毒性のあるピリジンを使うなど問題点が多かった。また、ヘモグロビンの定量に関し、試験検体中のヘモグロビンの非蛍光性ヘム部分を蛍光性ポルフィリンに定量的に変換し、その蛍光を検出して、検体中のヘモグロビン量を測定する方法も提案されているが(特許文献1と2参照)、煩雑な操作を要するものであり実用的ではなかった。



本発明者らは、ヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO)の強固なヘム結合性を利用して、HOのアミノ酸改変及び蛍光プローブ修飾により、遊離型ヘムに応答する人工センサーを構築し、簡便かつ高感度な測定法を開発し提案した(非特許文献3と4)。しかしながら、この測定法では、微量なヘム濃度差を検出する場合に、感度面で不十分であるという問題があった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ヘムを含む金属プロトポルフィリン錯体の定量方法と、それに用いる酵素センサーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
蛍光色素で蛍光ラベル化されたヘムオキシゲナーゼを用いる金属プロトポルフィリン錯体の定量方法において、蛍光色素として、親水性で、かつ、その蛍光波長が金属プロトポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような蛍光色素を用い、前記ヘムオキシゲナーゼが、ラットヘムオキシゲナーゼの18番目の残基をシステインに変異させ、該位置に親水性蛍光色素を導入したものであることを特徴とする金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項2】
 
前記システインへの変異は、前記18番目の残基のみになされていることを特徴とする請求項1記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項3】
 
前記ラットヘムオキシゲナーゼは、C末端膜結合部分を除去して水溶性とされたものであることを特徴とする請求項1又は2記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項4】
 
前記金属プロトポルフィリン錯体がヘムであり、前記親水性蛍光色素の最大蛍光波長が450nm以下であることを特徴とする請求項1~3のいずれか1項に記載の金属プロトポルフィリン錯体の定量方法。

【請求項5】
 
蛍光色素の蛍光波長が金属プロトポルフィリン錯体の吸収波長と重なるような親水性蛍光色素で蛍光ラベル化されたヘムオキシゲナーゼからなり、前記ヘムオキシゲナーゼが、ラットヘムオキシゲナーゼの18番目の残基をシステインに変異させ、該位置に親水性蛍光色素を導入したものである酵素センサー。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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