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POLYION DENDRIMER FOR INTRACELLULARLY INTRODUCING PROTEIN commons

Patent code P100000580
File No. BE063P15
Posted date Mar 12, 2010
Application number P2010-047133
Publication number P2011-178756A
Patent number P5346307
Date of filing Mar 3, 2010
Date of publication of application Sep 15, 2011
Date of registration Aug 23, 2013
Inventor
  • (In Japanese)相田 卓三
  • (In Japanese)大黒 耕
  • (In Japanese)金原 数
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title POLYION DENDRIMER FOR INTRACELLULARLY INTRODUCING PROTEIN commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a polyion dendrimer capable of intracellularly transporting a protein by such a simple operation as to merely make mixing through utilizing intermolecular interaction via no covalent bond, thus useful as a highly versatile protein transporter, and to provide a method for transporting such a protein in high efficiency using the same.
SOLUTION: The polyion dendrimer is provided, being characterized by including cationic groups selected from guanidine groups, thiourenium groups and isothiourenium groups on its surface, having polyalkyleneoxy groups as branched chains, and also in that benzophenone group-bearing substituents are bound to the core part. A protein transporter using the polyion dendrimer, and a method for transporting a protein using the transporter, are also provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


タンパク質は、その機能の特異性や生体適合性の高さから新しいタイプの薬剤として注目されている。一般にタンパク質のような高分子化合物は細胞膜透過性が極めて低いという問題があるために、効率的な細胞内導入を可能にするキャリアの使用が必要不可欠である。
タンパク質の細胞内取り込みを実現するアプローチの一つとして、アルギニンを多数含有する細胞内輸送ペプチドを連結させる方法が知られている (非特許文献1参照) 。しかしながら、この方法ではペプチドを共有結合で標的のタンパク質に連結させる必要があるため、タンパク質の変性や機能の損失を引き起こす可能性があるという問題があった。



もう一つのアプローチとして、カチオン性脂質を用いた非共有結合的方法が提案されている(非特許文献2参照)。この方法は、カチオン性脂質がタンパク質を内包するミセルを形成し、このミセルが細胞膜と融合することを利用して、標的タンパク質を細胞内に移行させる方法である。この方法では、前述の細胞内輸送ペプチドを用いる方法と異なり、共有結合形成を必要としないため、標的タンパク質の変性や失活を回避することができる。しかしながら、カチオン性脂質を用いたタンパク質輸送は10μM以上の濃度の脂質分子を必要とするため、拡散の影響で希釈されてしまうin vivoでは十分な輸送効率を実現できていなかった。このため、in vivoで、タンパク質をそのまま効率よく細胞内に輸送できるキャリアの開発が待たれていた。



デンドリマーは、ギリシャ語の「dendri-」(樹木状)と「meros」(一部)を組み合わせて名づけられた、中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、構造が正確にコントロールされた樹木状のポリマーである。過去10年間に5000以上の論文が発表されてきているが、他の高分子と比べて合成が極めて困難であるため、実用化は難しいとされている。現在最もよく用いられているポリアミドアミン構造を持つPAMAMデンドリマーなどは、既に市販されてきている。
デンドリマーは、コア (core) と呼ばれる中心分子と、デンドロン (dendron) と呼ばれる樹状の分岐構造部分、及び表面(surface)と呼ばれる末端基部分から構成され、デンドロン部分の分岐回数を世代 (generation) と言っている。一般に高分子はある程度の分子量分布を持つが、高世代のデンドリマーは、分子量数万に達するものでもほとんど単一分子量であるという、際立った特徴を持っている。
コア(core)はデンドリマー全体のサイズ・形・方向性・多様性を決定する部位であるとされており、デンドロン (dendron) は、枝状のセルが規則的に増えていく部分で、このセルが空間のタイプと大きさを決定し、枝状のセルの多重度は世代(generation)に対して指数関数的に増加する。表面(surface)は反応性・非反応性の末端基で構成され、末端基のタイプにより様々な機能を発現することができると共に、外部のゲスト分子の出入りをコントロールするゲートの役割も担っている。



デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば、リジン単位の層に基づくデンドリマーの製造法(特許文献1参照)、ポリアミドアミンを含む他の単位に基づくデンドリマーやPAMAMデンドリマーの製造法(特許文献2参照)などが報告されている。これらのデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤又は油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、及び塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適するとされているが、医薬製造用の基剤としての使用(特許文献3参照)や、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合させるためのもの(特許文献4参照)なども既に報告されてきている。
また、表面の末端基としてグアニジン基のようなカチオン性の基を有するデンドリマー(樹状高分子化合物)も知られており、例えば、ポリアミドアミンデンドリマーやポリリジンデンドリマーやポリ(プロピレンイミン)デンドリマーなどの表面に4級アミノ含有部
分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分などのイオン性基を設けたデンドリマーを毒性物質による疾患の予防又は治療に用いるもの(特許文献5参照)や、同じデンドリマーを細菌などの微生物又は寄生虫による疾患の予防又は治療に用いるもの(特許文献6参照)、また、このようなイオン性末端基を有するデンドリマーをゲル形成剤として農薬や衛生用品の担体として使用するもの(特許文献7参照)などが報告されている。さらに、カチオン性の基を有するポリエチレンイミンデンドリマーなどのカチオン性物質をアニオン性の酵素活性蛍光基質と複合させて蛍光基質の膜輸送系を形成させる方法も報告されている(特許文献8参照)。
しかしながら、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合しているものは知られていない。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。本発明のポリイオンデンドリマーは、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送できる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用であり、本発明は、さらに本発明のポリイオンデンドリマーを用いたタンパク質輸送剤、及び生体細胞内へのタンパク質の輸送方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
デンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。

【請求項2】
 
分岐鎖が、末端に1,4位で結合した1,2,3-トリアゾ-ル基を有していてもよい繰り返し回数1~6のポリエチレンオキシ基である請求項1に記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項3】
 
分岐部分が、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸アミド又は3,4,5-トリヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである請求項1又は2に記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項4】
 
ベンゾフェノン基を有する置換基が、次の一般式[2]又は[3]、
【化15】
 


[式中、kは0又は1~5の整数を表す。]
【化16】
 


[式中、kは0又は1~5の整数を表す。]
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基である請求項1~3のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項5】
 
世代が、1~5世代である請求項1~4のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項6】
 
ポリイオンデンドリマーが、次の一般式[1]
【化17】
 


[式中、Xは次に示す一般式[2]又は[3]、
【化18】
 


[式中、kは0又は1~5の整数を表す。]
【化19】
 


[式中、kは0又は1~5の整数を表す。]
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基を示し、Yは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、lは1~6の整数を表し、mは0又は1を表し、nは世代数を示し1~5の整数を表す。なお、式中の分岐部分の3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸アミドは、3,4,5-トリヒドロキシ桂皮酸アミドであってもよく、分岐鎖のエチレンオキシ鎖は、炭素数1~6、好ましくは2~5の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖であってもよい。]
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項1~5のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項7】
 
ポリイオンデンドリマーが、次の一般式[4]
【化20】
 


[式中、Yは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、mは0又は1を表す。]
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項1~6のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項8】
 
ポリイオンデンドリマーが、次の式[5]
【化21】
 


で表されるポリイオンデンドリマーである請求項1~7のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。

【請求項9】
 
請求項1~8のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤。

【請求項10】
 
請求項9に記載のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法(ただし、ヒトの生体内において行う場合を除く)
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) ERATO/SORST Creating and applying electronic nano-space by molecular programming AREA
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