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METHOD FOR MEASURING MITOCHONDRIAL METABOLIC ACTIVITY

Patent code P100000678
File No. I028P001
Posted date May 14, 2010
Application number P2010-075564
Publication number P2011-205935A
Patent number P5477791
Date of filing Mar 29, 2010
Date of publication of application Oct 20, 2011
Date of registration Feb 21, 2014
Inventor
  • (In Japanese)藤川 誠
  • (In Japanese)吉田 賢右
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title METHOD FOR MEASURING MITOCHONDRIAL METABOLIC ACTIVITY
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply measuring mitochondrial metabolic activity without damaging a mitochondrial membrane.
SOLUTION: The method for measuring mitochondrial metabolic activity includes adding a hypotonic solution for cell penetration to cells treated with a streptolysin O-containing solution, performing permeation and measuring energy metabolic activity of mitochondria of the permeated cells.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



従来、哺乳類FoF1-ATP合成酵素のATP合成活性を測定するには、肝臓などの組織や培養細胞からのミトコンドリア画分を調製する必要があった。かかるミトコンドリア画分の調製には、組織や細胞の低張処理後にホモホジナイザーにより細胞膜を破砕して、その抽出液を低速遠心にて核を除去、その抽出液をさらにショ糖勾配を利用した高速遠心してミトコンドリアを沈殿させていた。この調製作業は煩雑な上、ミトコンドリア膜の損傷が問題となっていた。





また、培養細胞の場合には、107細胞ほどを集めて、ジギトニンなど穏和な界面活性剤により透過処理を行った上で活性測定する方法も知られている(非特許文献1参照)。この方法も、上記の方法と同様に、細胞の剥離、遠心、洗浄など作業が煩雑であり、さらに、界面活性剤が、細胞膜だけでなくミトコンドリア膜へも損傷を与えるという問題があった。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、ハイスループットスクリーニングに適用可能なミトコンドリア代謝活性測定法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ストレプトリジンO(StreptolysinO)含有液を用いて細胞をインビトロで透過処理し、該透過処理した細胞のミトコンドリアのエネルギー代謝活性を測定する方法であって、ストレプトリジンO含有液を添加して15℃以下で反応させた後、細胞透過用低張液を添加して25~45℃で反応させ透過処理を行うことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項2】
 
透過処理した細胞に対して、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液を添加することを特徴とする請求項1記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項3】
 
細胞が培養細胞であることを特徴とする請求項1又は2記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項4】
 
105個以下の細胞を用いて測定を行うことを特徴とする請求項1~3のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項5】
 
プレート上で培養した細胞に対して、直接透過処理を行うことを特徴とする請求項1~4のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項6】
 
区分けされた複数区画の細胞に対して同時に透過処理を行うことを特徴とする請求項1~5のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項7】
 
FoF1-ATP合成酵素によるATP合成活性を測定することを特徴とする請求項1~6のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項8】
 
ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光を検出することによりATP合成活性を測定することを特徴とする請求項1~7のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項9】
 
ミトコンドリア膜電位に関連する蛍光を検出することにより呼吸鎖活性を測定することを特徴とする請求項1~7のいずれか記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項10】
 
発光又は蛍光を定量することによりATPを定量することを特徴とする請求項8又は9記載のミトコンドリア代謝活性測定方法。

【請求項11】
 
ストレプトリジンO含有液と、細胞透過用低張液と、アデニル酸キナーゼ阻害剤を含む測定用反応液とを備えたことを特徴とするミトコンドリア代謝活性測定用キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2010075564thum.jpg
State of application right Registered
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