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(In Japanese)タンパク質又は遺伝子導入用試薬 foreign

Patent code P100001081
File No. WASEDA-134-PCT
Posted date Oct 21, 2010
Application number P2008-545466
Patent number P5403324
Date of filing Nov 26, 2007
Date of registration Nov 8, 2013
International application number JP2007073266
International publication number WO2008062911
Date of international filing Nov 26, 2007
Date of international publication May 29, 2008
Priority data
  • P2006-317841 (Nov 24, 2006) JP
Inventor
  • (In Japanese)武岡 真司
  • (In Japanese)武田 直也
  • (In Japanese)胡桃坂 仁志
  • (In Japanese)坂根 勲
  • (In Japanese)池ヶ谷 菜海子
  • (In Japanese)小幡 洋輔
  • (In Japanese)齋藤 俊介
Applicant
  • (In Japanese)学校法人早稲田大学
Title (In Japanese)タンパク質又は遺伝子導入用試薬 foreign
Abstract (In Japanese)本発明は、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬を提供する。
本発明の試薬は、例えば、下記式(I)-1:



(式(1)-1中、式中、Lは、単結合、又は-CONH-若しくは-S-S-であり、M1は、-(CH2k-又は-(CH2CH2O)k-(kは0~14の整数である。)であり、m1及びm2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す(但し、細胞への遺伝子導入用試薬の場合は、m1及びm2がいずれも15である場合は除く。)。)
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用試薬である。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



人工の二分子膜からなる小胞体又はリポソームに有用物質を内包させる技術は、医薬品、香粧品、食品、染料などの分野で盛んに研究されている。

リポソームの膜構成脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン及びコレステロールなどの膜構成脂質と、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリンなどの負電荷リン脂質との混合脂質が広く用いられている。

近年では、カチオン性脂質単独またはそれを含むリポソームを用いて、遺伝子と複合体を形成することにより、細胞内に遺伝子を導入する研究が行われている(Hong Sung Kim et al.,Gene-tranferring efficiencies of novel diaminocationic lipids with varied hydrocarbon chains.Bioconjugate Chem.2004,15,1095)。既存の遺伝子導入用カチオン性脂質、例えば1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane(DOTAP)、3β-N-(N’,N’,-dimethyl-aminoethane)-carbamoyl cholesterol(DC-Chol)、1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium(DMRIE)、2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate(DOSPA)、dioctadecyldimethylammonium chloride(DODAC)、N-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium(DOTMA)、didodecyldimethylammonium bromide(DDAB)、リポフェクトアミンなどは、脂質成分の親水部に正電荷を付与させるために4級アミンを有するものがほとんどである。これらカチオン性脂質を用いた遺伝子導入系においては、ポリエチレンイミンなどのカチオン性高分子を用いた遺伝子導入キャリアとは異なり、DNAとの複合体がエンドソームから離脱するプロトンスポンジ効果を有さない。そのため、既存の遺伝子導入用カチオン性脂質には通常、膜融合性脂質である1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン(DOPE)が混合されている。カチオン性脂質によりDNAを濃縮安定化させる作用を有し、DOPEによりエンドソーム膜との融合を促すことで、このカチオン性脂質-DNA複合体がエンドソーム膜外に放出される。これにより、カチオン性脂質により濃縮安定化されたDNAの核内への導入が達成される(L.Stamatatos et al.,Interactions of cationic lipid vesicles with negatively charged phospholipid vesicles and biological membranes.Biochemistry 1988,27,3917;特表平 11-504631号公報)。

しかし、上記遺伝子導入用カチオン性脂質の合成はその化学構造が複雑であるために容易に合成できず、これらの遺伝子導入試薬の価格が高いのが現状である。また、4級アミンを有する遺伝子導入用脂質はそのカチオン性が強力なため、血清成分との凝集を引き起こしやすく、血清存在下での遺伝子導入効率を著しく低下させる要因になる。さらに、これらのカチオン性脂質は細胞膜表面のリン脂質にも強く相互作用するため、細胞毒性も高い。

一方、タンパク質を外部から細胞内に導入する場合も運搬体が必要であり、その運搬体として、脂質系(Profect P-1、BioPORTER、SAINT-MIX等)やペプチド系(Profect P-2、Chariot等)などの試薬がすでに市販されている。しかし、これらの運搬体のほとんどは、単純にタンパク質と混合して複合体を形成させ、細胞に添加して使用するため、複合体の大きさの制御ができないことが多い。また、特に脂質系運搬体については、細胞培養液に血清タンパク質が含まれている場合には目的タンパク質の導入効率が大幅に低下するため、血清不含有培地での実験を行なう必要がある。さらに、過剰の脂質運搬体が遊離して存在すると、顕著な細胞毒性が現れることがある。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬及び遺伝子導入用試薬に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
次式(I)-1:
【化1】
 


(式中、Lは、単結合、又は-CONH-若しくは-S-S-であり、M1は、-(CH2k- 又は-(CH2CH2O)k- (kは111の整数である。)であり、m1及びm2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す。)
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬。

【請求項2】
 
次式(I)-1:
【化2】
 


(式中、Lは、単結合、又は-CONH-若しくは-S-S-であり、M1は、-(CH2k- 又は-(CH2CH2O)k- (kは111の整数である。)であり、m1及びm2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す(但し、m1及びm2がいずれも15である場合は除く。)。)
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞への遺伝子導入用試薬。

【請求項3】
 
組成物が、さらにジアシルホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子からなる群から選ばれる少なくとも1つを含むものである、請求項1又は2に記載の試薬。

【請求項4】
 
ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基である、請求項3記載の試薬。

【請求項5】
 
組成物が、水性媒体中に分散してなる分子集合体である、請求項1又は2に記載の試薬。

【請求項6】
 
分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである、請求項5記載の試薬。

【請求項7】
 
組成物が、乾燥粉末品である、請求項1又は2に記載の試薬。

【請求項8】
 
乾燥粉末品は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得るものである、請求項7記載の試薬。

【請求項9】
 
細胞が、生体組織の一部を構成しているもの、又は血漿、血清若しくは血液、若しくはそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞である、請求項1又は2に記載の試薬。

【請求項10】
 
請求項1~9のいずれか1項に記載の試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キット。

【請求項11】
 
次式(I)-3:
【化3】
 


(式中、M2は、-(CH2k’- 又は-(CH2CH2O)k’- (k’は1~14の整数である。)であり、p1及びp2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す。)
で示される、カチオン性アミノ酸型脂質。

【請求項12】
 
次式(I)-1:
【化4】
 


(式中、Lは、-CONH-又は-S-S-であり、M1は、-(CH2k- 又は-(CH2CH2O)k- (kは2~14の整数である。)であり、m1及びm2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す。)
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞へのタンパク質導入用試薬。

【請求項13】
 
次式(I)-1:
【化5】
 


(式中、Lは、-CONH-又は-S-S-であり、M1は、-(CH2k- 又は-(CH2CH2O)k- (kは2~14の整数である。)であり、m1及びm2はそれぞれ独立して、11~21の整数を表す(但し、m1及びm2がいずれも15である場合は除く。)。)
で示されるカチオン性アミノ酸型脂質を含む組成物を含有する、細胞への遺伝子導入用試薬。

【請求項14】
 
組成物が、さらにジアシルホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール鎖が結合した両親媒性分子からなる群から選ばれる少なくとも1つを含むものである、請求項12又は13に記載の試薬。

【請求項15】
 
ジアシルホスファチジルコリンのアシル鎖の一部又は全部がオレオイル基である、請求項14記載の試薬。

【請求項16】
 
組成物が、水性媒体中に分散してなる分子集合体である、請求項12又は13に記載の試薬。

【請求項17】
 
分子集合体は、二分子膜小胞体構造を形成し、内水相にタンパク質又は遺伝子を含むものである、請求項16記載の試薬。

【請求項18】
 
組成物が、乾燥粉末品である、請求項12又は13に記載の試薬。

【請求項19】
 
乾燥粉末品は、水性媒体中に分散したときにタンパク質又は遺伝子を包含した二分子膜小胞体構造を形成し得るものである、請求項18記載の試薬。

【請求項20】
 
細胞が、生体組織の一部を構成しているもの、又は血漿、血清若しくは血液、若しくはそれらの成分の一部を含む培地にて培養された細胞である、請求項12又は13に記載の試薬。

【請求項21】
 
請求項12~20のいずれか1項に記載の試薬を含む、細胞へのタンパク質又は遺伝子導入用キット。

【請求項22】
 
kが3~5の整数である、請求項1に記載の試薬。

【請求項23】
 
kが3~5の整数である、請求項2に記載の試薬。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2008545466thum.jpg
State of application right Registered
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