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METHOD FOR DETERMINING ESTROGEN-RELATED DISEASE

Patent code P110001749
Posted date Mar 15, 2011
Application number P2010-178128
Publication number P2012-034633A
Patent number P5804341
Date of filing Aug 6, 2010
Date of publication of application Feb 23, 2012
Date of registration Sep 11, 2015
Inventor
  • (In Japanese)水上 洋一
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title METHOD FOR DETERMINING ESTROGEN-RELATED DISEASE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for determining an estrogen-related disease by identifying SNP (single nucleotide polymorphism) of membrane-bound female hormone receptor GPR30 (G-protein coupled receptor 30) existing in an estrogen-related disease tissue and elucidating functions of GPR30 having genetic polymorphism, and a method for screening a therapeutic agent of estrogen-related disease.
SOLUTION: The method for determining the estrogen-related disease includes detecting at least one kind of SNP existing in ORF (Open Reading Frame) of human GPR30 gene. The method for screening a therapeutic agent of estrogen-related disease includes: a process of expressing GPR30 containing at least one kind of SNP existing in ORF of human GPR30 gene, bringing a substance to be tested into contact with a cell line having a low degree of cell death in comparison with a cell line expressing a wild-type GPR30, analyzing the degree of cell proliferation and selecting a substance for controlling cell proliferation; or a process of analyzing the degree of cell death and selecting a substance for promoting cell death.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


ある集団で1%以上の遺伝子の変異が観察されるものを多型といい、特に一塩基だけが変異したものを一塩基多型(SNP;single nucleotide polymorphism)と呼ぶ。これまでに、ヒトゲノムには1億4千2百万のSNPが同定され、1.9キロ塩基ごとに1つの頻度でSNPが存在すること、そして、そのうち6万個のSNPがエキソン(コーディング領域と非翻訳領域)に存在していることなどが明らかになっているが(非特許文献1)、各SNPの詳細な機能についてはほとんど明らかになっていない。



タンパク質のコーディング領域(ORF;オープンリーディングフレーム)におけるミスセンスSNPは、タンパク質におけるアミノ酸配列の変更を伴い、その機能に影響を与える可能性がある。タンパク質の機能に関与するSNPは、個人の体質、薬剤に対する応答、疾患の発症や悪化等に関連している可能性高いことから、重要であるといわれている。特に疾患と関連のあるSNPは臨床分野での疾患の診断や薬剤の使い分けのマーカーとして有用であり、オーダーメイド医療の実現化につながると期待されている。



女性ホルモンの一種であるエストロゲン(E2)は多彩な生理作用を有しており、エストロゲンによる調節は内分泌系、生殖器、骨組織、血管系で重要な役割を担っている。そして、その異常は異常骨吸収、心血管疾患、中枢神経系傷害及びがんなど種々の疾患の発生や進行に関与すると考えられている。エストロゲンによる調節を受ける細胞には、エストロゲンを認識する受容体タンパク質が存在し、そのシグナルを伝達していると考えられている。そのため、エストロゲン受容体の同定とその機能や制御メカニズムについて明らかにすることは、これらの疾患を治療・予防において、極めて重要である。



エストロゲン受容体として、細胞内に存在するDNA結合型の核内受容体ER(Estrogen Receptor)が同定され、多くの研究がなされている。そして、ER結合性のタモキシフェンやラロキシフェンは、選択的エストロゲン受容体調節薬として、様々なエストロゲンに関連する疾患の治療薬として現在広く用いられている。



その一方で、エストロゲンは血管の弛緩作用や細胞内Ca2+の流入など、転写が関与しない急性期の反応を引き起こすことも知られており、細胞膜上にもエストロゲン受容体が存在することが示唆されていた。その実体は長らく明らかではなかったが、オーファン受容体であったGPR30(G-protein coupled receptor 30)が、エストロゲンの細胞膜受容体として同定され(非特許文献2、3)、子宮筋腫や乳がんなどエストロゲン関連疾患との関連が注目されている。細胞膜上のエストロゲン受容体を標的とした治療薬は、従来の核内エストロゲン受容体ERをターゲットとした治療薬に対し、難治性を示すタイプの患者に有効であることが期待できる。さらに、細胞膜型エストロゲン受容体をターゲットとする薬剤は、必ずしも細胞内や核内に侵入する必要がないため、副作用の低い治療薬開発も期待できる。



ヒトGPR30は、1128塩基、375アミノ酸からなる、推定分子量が約41kDaの7回膜貫通型Gタンパク質共役型受容体のひとつである。本発明者らはGPR30を特異的に認識する抗体を開発し、ラット脳組織の内在性GPR30及びHeLa細胞に過剰発現させたFLAG-GPR30が細胞膜上に局在すること、HeLa細胞に発現させたFLAG-GPR30がエストロゲン応答性を有し、エストロゲン依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こすことや、エストロゲン依存的に細胞内へ取り込まれることを明らかにしている(特許文献1、非特許文献4、5)。核内受容体ERには結合せず、GPR30に結合する特異的アゴニストG-1(1- (4- (6-Bromobenzo [1,3] dioxol-5-yl) -3a, 4, 5, 9b-tetrahydro-3H-cyclopenta [c] quinolin-8-yl) -ethanone)の発見(非特許文献6)や、GPR30ノックアウト動物を用いた解析(非特許文献7~10)により、GPR30の生物学的機能の解析が進み、免疫系や循環系、血糖調節における機能が明らかになりつつある。しかしながら、GPR30の生殖器における発現や機能、エストロゲン関連疾患との関連は明らかではない。



非特許文献7~10のGPR30ノックアウトマウスにエストロゲン関連疾患の表現型が見られないことから、未知の変異によるGPR30の機能の異常がエストロゲン関連疾患の病態に関連している可能性が考えられる。その一方で、本発明者らが別途作製したGPR30ノックアウトマウスは早期の胎生致死であるという異なる結果も得られている。この理由については明らかではないが、いずれにしてもGPR30とエストロゲン関連疾患との関連を明らかにするためには、ノックアウトマウス以外を用いた解析、例えば未知の変異によるGPR30の機能の異常に着目した解析が重要だと考えられる。



また、胃癌の組織及び細胞特異的に、GPR30の3’非翻訳領域における2塩基の欠失が検出され、胃癌との関連が示唆されている(非特許文献11)。この3’非翻訳領域における変異により、GPR30の3’非翻訳領域に存在するalternative splicing form、LERGU(Leucine Rich Protein in GPR30 3’UTR)にフレームシフトが起こり、変異LERGUが胃癌の進展に関与している可能性が推測されているが、GPR30の発現や機能への影響、エストロゲンシグナルとの関連は全く明らかではない。



NCBIが提供するSNPデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)を利用した検索では、GPR30のORFにおいて9個のSNPが存在することが確認できる。しかし、これらのSNPによるGPR30の機能への影響や、疾患との関連は全く明らかではなく、GPR30のORFにおけるSNPと疾患との関係の有無等を明らかにするためには、疾患患者の組織の解析及びその結果の健常者組織の解析結果との比較が必要であった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、膜結合型女性ホルモン受容体GPR30(G-protein coupled receptor 30)遺伝子のORFに存在する少なくとも1種の一塩基多型を解析するエストロゲン関連疾患の判定方法や、GPR30を標的としたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ヒトGPR30遺伝子のORFに存在する一塩基多型を検出することを含むことを特徴とする子宮筋腫の判定を補助する方法であって、一塩基多型が、配列番号1に示される塩基配列の14番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型である方法。

【請求項2】
 
ヒトGPR30遺伝子のORFに存在し、配列番号1に示される塩基配列の14番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型を含むGPR30を発現し、野生型GPR30を発現する細胞株に比べて細胞死の程度が低いことを特徴とする細胞株。

【請求項3】
 
請求項2記載の細胞株に被検物質を接触させ、1)細胞の増殖の程度を分析し、細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程;又は2)細胞死の程度を分析し、細胞死を促進する物質を選択する工程;を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法。

【請求項4】
 
ヒト又は非ヒト動物のGPR30遺伝子のORFに存在し、配列番号1に示される塩基配列の14番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型、又は非ヒト動物のGPR30ホモログ遺伝子に保存された、配列番号1に示される塩基配列の14番目の塩基に相当するシトシンがチミンである一塩基多型を含むGPR30を発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。

【請求項5】
 
請求項4記載の変異GPR30発現トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、子宮筋腫の大きさを測定し、子宮筋腫を縮小させる物質を選択する工程を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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