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METHOD FOR DETECTING COMPOUND INTERACTING WITH MOLECULE ON CELL MEMBRANE meetings achieved

Patent code P110001856
File No. 631-0563
Posted date Mar 18, 2011
Application number P2010-157181
Publication number P2012-016333A
Patent number P5773405
Date of filing Jul 9, 2010
Date of publication of application Jan 26, 2012
Date of registration Jul 10, 2015
Inventor
  • (In Japanese)本家 孝一
  • (In Japanese)小谷 典弘
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人高知大学
Title METHOD FOR DETECTING COMPOUND INTERACTING WITH MOLECULE ON CELL MEMBRANE meetings achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a compound interacting with a target molecule on a cell membrane with high accuracy by eliminating a nonselective bounding of a labelling compound as much as possible, and to provide a kit that can be used with the method.
SOLUTION: The method for detecting the compound interacting with the molecule on the cell membrane includes: a step of acting the compound having a selective binding part to the molecule on the target cell membrane and a radicalization promoting part on the cell; a step of further acting a specified compound (I) on the cell; and a step of specifying a compound in which the compound (I) is bound.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


細胞膜を構成するリン脂質二重層中には、多数のタンパク質やリン脂質以外の脂質などが存在しており、増殖因子受容体や細胞接着因子、イオンチャネル等として機能しているものがある。これら細胞膜上分子は、細胞膜内を比較的自由に移動することができ、集合や解離を繰り返している。特に、細胞膜上分子が複数集合し、細胞膜表面に露出したラフトと呼ばれるものは、細菌やウィルスなどの受容体や、細胞外情報が細胞内に伝達される際のプラットフォームになるなど、重要な役割を担う。よって、ある細胞膜上分子が、他のいかなる細胞膜上分子と協働して機能するかを知ることは、生化学的研究において極めて重要である。



ところが、細胞膜上分子間の相互作用の解析は、非常に難しい。例えば、ある標的タンパク質と相互作用するタンパク質を分離検出する方法として、標的タンパク質に特異的な抗体を作用させて選択的に沈殿させる免疫沈降法が知られている。しかし、この方法では、標的タンパク質と他のタンパク質が生理条件下で相互作用した状態を反映させるのは困難である。何故ならこの方法では、細胞膜上で標的タンパク質に他のタンパク質が相互作用している場合であっても、細胞膜から標的タンパク質を分離した段階でかかる相互作用が解消される可能性があるためである。また、生細胞の細胞膜上では相互作用していないにも関わらず、タンパク質の分離段階で擬性の相互作用が生じる場合もある。



他には、標的タンパク質にクロスリンカーを結合し、相互作用するタンパク質と架橋させて特定するクロスリンカー法が知られている。しかし、当該方法では、クロスリンカー分子の長さと形状が固定されるため、架橋され検出されるのは一部の密着したタンパク質のみとなる。その結果、このクロスリンカー法による細胞膜上分子間の相互作用の解析では、成功例が少ない。



従って、上記以外の方法で、細胞膜上分子間の相互作用を検出することに特化した技術が検討されている。



本発明者らは、細胞膜上分子間の相互作用を検出するための技術を開発している(特許文献1)。当該技術では、先ず、細胞膜上の標的分子へ選択的に結合するものであり、且つ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などラジカル化を促進する化合物(第1試薬)を細胞に作用させた後、さらにラジカル化される基と標識基とを有する化合物(第2試薬)を作用させる。その結果、標的分子へ選択的に結合した第1試薬のHRPなどにより第2試薬がラジカル化され、標的分子の近傍に存在する化合物へ結合する。第2試薬は標識基を有するため、細胞膜において標的分子と相互作用をしていた化合物を特定することができる。なお、特許文献1には、第2試薬の標識基として、ビオチン、蛍光発色基、放射性同位元素含有基、標識ペプチド、ハプテンが例示されている。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、細胞膜上分子と相互作用する化合物を検出する方法と、当該方法を実施するためのキットに関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞膜上分子と相互作用する化合物を検出する方法であって、
標的細胞膜上分子への選択的結合部分とラジカル化促進部分としてペルオキシダーゼまたはヘム化合物とを有する化合物を、細胞に作用させる工程;
式(I)で表される化合物を、さらに細胞に作用させる工程;
X-Y-Z-N3 (I)
[式中、Xは蛍光フルオレセイン誘導体基を示し、Yはリンカー基を示し、Zは置換基を有していてもよいC6-12アリーレン基を示す]
化合物(I)が結合した化合物を特定する工程
を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】
 
蛍光フルオレセイン誘導体基がフルオセイン基である請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
化合物(I)が結合した化合物を、SDS-PAGEを利用して特定する請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
標的細胞膜上分子への選択的結合部分ラジカル化促進部分としてペルオキシダーゼまたはヘム化合物とを有する化合物、および
式(I)で表される化合物
X-Y-Z-N3 (I)
[式中、Xは蛍光フルオレセイン誘導体基を示し、Yはリンカー基を示し、Zは置換基を有していてもよいC6-12アリーレン基を示す]
を含むことを特徴とするキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Shikoku TLO is introducing the seeds of 4 inside 20 university and a technical college. Please ask to the following about the detailed contents of seeds. I am waiting for an inquiry.


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