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(In Japanese)同位体化合物を標識として使用するタンパク質の分析方法 commons meetings foreign

Patent code P110001986
File No. FU217
Posted date Mar 23, 2011
Application number P2009-520532
Patent number P4883540
Date of filing Jun 19, 2008
Date of registration Dec 16, 2011
International application number JP2008061243
International publication number WO2008156139
Date of international filing Jun 19, 2008
Date of international publication Dec 24, 2008
Priority data
  • P2007-164249 (Jun 21, 2007) JP
Inventor
  • (In Japanese)松川 茂
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人福井大学
Title (In Japanese)同位体化合物を標識として使用するタンパク質の分析方法 commons meetings foreign
Abstract (In Japanese)本発明は、式(I):



(式中、R1、R2及びR3はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す)
で表される化合物又はその塩の2種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含む、タンパク質分析方法を提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


様々な生物のゲノム構造解析が進展して、細胞内で働くことがあると予想されるタンパク質の候補がその一次構造情報として集積されてきた。しかし、遺伝子情報から引き出されるタンパク質情報はあくまでも情報であり、実体ではないことに注意が必要である。事実、細胞や組織では核内の全遺伝子情報の一部しか翻訳されていないといわれ、しかも、細胞や組織の由来によってその種類は様々である。また、発生から分化の過程でも、発現するタンパク質の質や量が刻々と変化しているようである。細胞内では、更に、多様なタンパク質が複雑に相互作用して細胞の生命活動を維持しているが、それら相互の関連を明らかにすることにより、遺伝子の機能解析を進めていくことが求められている。



プロテオーム解析は、細胞の機能を支える多様なタンパク質間の関係を総合的にとらえようとする試みである。この目的に合致する合理的方法論が開発されてきているが、ある特定の代謝反応に関与するタンパク質の一群の構成成分を明らかにすること(同定)さえも、現状では多くの困難を伴う。このように多様性に富むタンパク質の集合であるプロテオームの変化を、総合的に、しかも迅速に把握することが求められている。



従来タンパク質の分離のために利用されているSDSゲル電気泳動法は、分子量に関して高い分離能を持つ。一方、タンパク質の荷電に基づき分離する等電点電気泳動法は、技術的な問題を克服しているが、試料調製に困難を抱えている。この両者の性質を併せ持つ分離技術である2次元電気泳動法は、現状では最も優れた分離能をもつ方法ではあるが、再現性に問題を残し、それを克服するために多色蛍光標識法と併用した所謂DIGE法が開発実用化されている。この方法は自動化が困難ではあるが、再現性や定量性の確保が難しいという問題はある程度克服された。



一方、液体クロマトグラフ、質量分析計及びデータ解析システムを結合し、試料の分離からタンパク質の同定に至る過程を一貫してオンラインで自動的に行う大規模なタンパク質同定システムが開発されている。このシステムは感度が極めて高く、試料はほんの少しでよいうえに質量が極めて正確に得られるため、標的タンパク質に由来する2、3種のペプチド断片の質量が分かるだけでそのタンパク質を同定することが出来ることが多い。或いは、質量分析を用いてペプチドのアミノ酸配列を直接決定し、そのアミノ酸配列からタンパク質を同定することも可能である。



また、正常と病態との間における細胞や組織内のタンパク質の量の変化や、発生中の組織、脳を含めた様々の疾患の組織、又は遺伝子の変異によって機能変化した組織で発現するタンパク質の量を知ることは、病態解明のための重要なヒントになる。それゆえ、細胞内のタンパク質を同定する技術だけでなく、タンパク質を定量する技術への需要もまた高まっている。
従来、標的タンパク質に対して特異的に結合する抗体の結合を間接的に検出することで標的タンパク質の存在量を相対的に決めてきた。この方法においては、標的タンパク質が既に同定されていて、かつそのタンパク質を検出できる抗体が得られている必要がある。
一方、同位体を利用して同一タンパク質に試料間で質量差を与えた後質量分析に付すことにより、存在比を分析する方法も現在用いられている。この方法は、未同定のタンパク質の同定と定量を一度の分析で達成出来る利点がある。この方法のために、ICAT(登録商標)試薬、iTRAQ(登録商標)試薬、ICPL(登録商標)試薬、NBS(登録商標)試薬などの標識試薬が利用されている(例えば、特許文献1参照)。また、軽酸素原子と重酸素原子とを含む2種類の水の中で対比試料に別々に消化酵素を働かせた時に、新生するカルボン酸のOHとして酸素が取り込まれ、質量差が2のペプチドが出来、それを質量分析で分離して量比を決める方法、或いはCやNの軽原子と重原子とを含むアミノ酸中で培養した細胞の全タンパク質をこれらのアミノ酸で構成するようにしてから両者の成分の存在比を調べる方法など多くの工夫がなされている。
上述した標識試薬の内、ICAT試薬及びNBS試薬については、それらが結合するアミノ酸残基はそれぞれシステイン及びトリプトファンであり、これらはタンパク質中での含有量が少ないため、タンパク質によっては分析にかからない場合があることや、2種の試料間での比較に限定されていることなど、様々の欠点を抱えている。また、タンパク質のリジン残基のアミノ基を標識するiTRAQ試薬とICPL試薬は、不安定な活性カルボン酸を用いてアミド結合を形成するために試薬の保存が難しい。また、これら4種類の試薬はいずれも高価であり、それもまたこれらの利用を制限する原因となっている。
【特許文献1】
特開2003-107066号公報

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、タンパク質を分析する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、質量分析計を用いて2種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析する方法に関する。本発明はまた、質量分析計を用いたタンパク質の分析に有用な試薬キットを提供する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
質量分析計を用いて2種以上のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を分析するタンパク質分析方法であって、式(I):
【化1】
 


(式中、R1、R2及びR3はそれぞれ同一又は異なって、水素、ハロゲン又はアルキルを示す)
で表される化合物又はその塩の2種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの前記タンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質に質量差を与えることを含み、且つ、
質量分析されるタンパク質を含有する内部標準試料もまた前記標識化合物の安定同位体の一つで標識して質量分析に付すこと、及び前記内部標準試料由来のMSスペクトル強度に対する前記タンパク質含有試料由来のMSスペクトル強度の比を求めることにより、それぞれの前記タンパク質含有試料に含まれる同種のタンパク質の量比を決定することを含み、ここで前記内部標準試料は、分析される全ての前記タンパク質含有試料から総タンパク質含有量が等しい出発試料をそれぞれ作製した後、前記出発試料を等量混合することによって作製されたものである、
タンパク質分析方法。

【請求項2】
 
式(I)の化合物が、2,4,6-トリメチルピリリウムである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が2以上である、請求項1に記載の方法。

【請求項4】
 
前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が4以上である、請求項1に記載の方法。

【請求項5】
 
式(I)で表される化合物の塩が、2,4,6-トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩であり、且つ、前記組み合わせに含まれる安定同位体間の質量差が4又は8である、請求項1に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2009520532thum.jpg
State of application right Registered
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