Top > Search of Japanese Patents > METHOD OF ASSAYING ACTIVITY OF HISTONE METHYLATION ENZYME

METHOD OF ASSAYING ACTIVITY OF HISTONE METHYLATION ENZYME

Patent code P110002522
File No. S2010-0701-N0
Posted date May 6, 2011
Application number P2010-202484
Publication number P2011-239775A
Patent number P5794659
Date of filing Sep 9, 2010
Date of publication of application Dec 1, 2011
Date of registration Aug 21, 2015
Priority data
  • P2010-096496 (Apr 19, 2010) JP
Inventor
  • (In Japanese)西野 憲和
  • (In Japanese)竹本 靖
  • (In Japanese)伊藤 昭博
  • (In Japanese)吉田 稔
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人九州工業大学
Title METHOD OF ASSAYING ACTIVITY OF HISTONE METHYLATION ENZYME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of assaying the activity of a histone methylation enzyme, a method of screening a compound which inhibits the activity of the histone methylation enzyme, a reagent kit for assaying the activity of the histone methylation enzyme, and a kit for screening the compound which inhibits the histone methylation enzyme.
SOLUTION: A substrate compound or its salt is represented by the following general formula (I). (In the general formula (I), R1 is a hydrogen atom or amino terminal protector group, X is a peptide including zero or one or more amino acid residues, K is a lysine residue, and R2 is a pigment marker.) In the substrate compound or its salt used, when an amino bond is cut by peptidase, the fluorescent characteristic or coloration characteristic of the pigment marker changes, and when the Åamino groups of the lysine residue are methylated by the histone methylation enzyme, the sensitivity to the peptidase is lowered. R1-X-K-R2 (I).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


真核生物の染色体DNAはタンパク質と複合体を形成しており、かかる複合体はクロマチンと呼ばれている。より詳細に述べると、クロマチンは、ヌクレオソームの繰り返し構造がらせん状につながったものであり、ヌクレオソームは、H2A、H2B、H3、H4の4種類のヒストンタンパク質を2分子ずつ含むヒストンコア(ヒストン8量体)に、146塩基対のDNAが1.75回転巻き付いた構造をとっている。DNAとヒストンの結合は転写に対して阻害的に働く。転写が活性な遺伝子座の染色体では、ヌクレオソームが緩んだり、ヒストンが解離していることが知られている。ヒストンは球形のカルボキシル末端と、直鎖状のアミノ末端(ヒストンテール)からなっており、ヒストンテールのリシン残基やアスパラギン残基は、アセチル化、メチル化、リン酸化、SUMO化などの様々な化学修飾を受けることが知られている。ヒストンのリシン残基のタンパク質翻訳後修飾のうち、アセチル化とメチル化についての概要を図1に示す。図1から分かるように、アセチル化の場合は、アセチル化の程度は1段階(アセチル化リシン(ε-N-アセチルリシン))であるのに対し、メチル化の場合は、メチル化の程度は通常3段階(モノメチル化リシン(ε-N-メチルリシン)、ジメチル化リシン(ε-N,N-ジメチルリシン)、トリメチル化リシン(ε-N,N,N-トリメチルリシン))である。



メチル化修飾は、転写の制御・サイレンシング・クロマチン凝縮などを引き起こすことが知られている。ヒストンのメチル化は、ヒストンメチル化酵素(histone methyltransferase:HMT)によって誘導される。これまでに知られているヒトのヒストンメチル化酵素名、該酵素がメチル化するリシンサイト(リシン部位)、及び、そのリシンサイトのメチル化による転写への影響(転写促進又は転写抑制)を図2に示す。ヒストンメチル化は、様々な疾患との関連が知られている。例えば、非特許文献1には、腫瘍の発達にSUV39H1、EZH2、MLL、NSD1、RIZ等の様々なヒストンメチル化酵素が関与することが記載されている。また、非特許文献2や3には、がん細胞で発現が抑制されているがん抑制遺伝子のプロモーター領域で、DNAのメチル化の増加やヒストンのアセチル化の減少と共に、ヒストンH3K9、及び、ヒストンH3K27のメチル化が認められることが記載されている。さらに、非特許文献4には、多くのがんに共通して、ヒストンH4K20のメチル化の増加が認められることが記載されている。また、非特許文献5には、ヒストンのメチル化により誘導されるヘテロクロマチン形成が、筋緊張性ジストロフィーやフリードライヒ運動失調症といった神経変性疾患に関わっていることが記載されている。また、非特許文献6には、Oct4/Klf2と遺伝子導入したマウス胚繊維芽細胞にL型カルシウムチャネルのアゴニストであるBayK8644、及びヒストンメチル化酵素G9aの阻害剤であるBIX-01294を添加することでiPS細胞へ誘導されたことが記載されている。



そのため、ヒストンメチル化酵素の阻害剤は、がんや神経変性疾患といった疾患への治療薬や、iPS細胞を用いた再生医療への応用が期待されている。そこで、ヒストンメチル化酵素阻害剤のスクリーニングが試みられている。例えば、非特許文献7には、メチル基がトリチウムラベルされたS-アデノシルメチオニン(S‐(5’-Adenosyl)-L-methionine:SAM)である[メチル-3H]-SAMと、ヒストンH3のアミノ酸番号1-19のアミノ酸配列から成るペプチド(ヒストンH3(1-19)ペプチド)と、ヒストンメチル化酵素とを混合して反応させた後、ヒストンH3(1-19)ペプチドの放射活性を測定することによって、リシンに転移したメチル基の量を測定し、それにより、該ヒストンメチル化酵素のヒストンメチル化活性を測定する方法(いわゆるRI法)が記載されている(図3)。また、非特許文献8には、Elisa法により、ヒストンメチル化酵素阻害剤をスクリーニングする方法が記載されている(図4)。しかし、RI法は、放射性同位体を用いるため安全性が十分とは言えない点や、反応生成物の濾紙への吸着、濾紙の洗浄といった実験操作数が比較的多く、煩雑である点などの問題点があった(図5)。また、図5にも示されているように、Elisa法は、洗浄操作といった実験操作数が極めて多く、所要時間も長いという問題点があった。このような状況下、ヒストンメチル化活性の評価系であって、安全性に問題がなく、かつ、実験操作が簡便で所要時間も短い評価系が求められていた。



一方、ヒストン脱アセチル化酵素活性の簡便な測定方法として、X-X-Lys(Ac)-(色素)で表される基質ペプチド(すなわち、特許文献1にてX-X-(Ac)Lys-(色素)で表される基質ペプチド)(式中Xは任意のアミノ酸残基を表し、Lys(Ac)はεアミノ基(ε位のアミノ基)がアセチル化されたリシン残基を表し、(色素)は該リシン残基に結合した色素標識を表す)を利用した方法が知られている(特許文献1参照)。この方法は、前述の基質ペプチドがアセチル化されたままの状態では、ある種のペプチダーゼによる切断活性が低下したままであるのに対し、前述の基質ペプチドが脱アセチル化されると、該ペプチダーゼによる切断活性が上昇する性質を利用している。



また、リシンのε位のメチル化に関していえば、非特許文献9や10には、ペプチドのリシン残基のε位をメチル化すると、メチル化していないものよりも、トリプシンに分解され難くなることが記載されている。しかし、リシンのε位のメチル化は、アセチル化とは違って3段階(モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化)あることや、前述の特許文献1における脱アセチル化とは逆に、反応の進行によってある種のペプチダーゼによる切断活性が低下することなどから、ヒストンメチル化酵素活性の測定方法に実際に用い得るかどうか不明であった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、ヒストンメチル化酵素活性の測定方法や、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法や、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キットや、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
次の(a)~(e)の工程を含むことを特徴とする、試料中のヒストンメチル化酵素活性を測定する方法;
(a)以下の一般式(I)
【化1】
 


(一般式(I)中、R1は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Xは0又は1個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Kはリシン残基を示し、R2はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、R2は、4-メチルクマリル-7-アミド基、2-アミノナフタレン-6-スルホン酸基、4-クロロメチルクマリル-7-アミド基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミド基、2-アミノ-7-メチルプリン-6-チオール基、ローダミン110基、ローダミン110モノアミド基、p-ニトロアニリド基及びβ-アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。)で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
(b)前記一般式(I)で表される基質化合物又はその塩と試料とを、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程;
(c)工程(b)の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程;
(d)工程(c)の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程;及び、
(e)工程(d)におけるメチル化レベルの上昇の程度を、試料中のヒストンメチル化酵素活性の程度と評価する工程。

【請求項2】
 
工程(d)における前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度の測定が、
前記基質化合物又はその塩におけるアミド結合がペプチダーゼによって切断されて、蛍光特性又は発色特性が変化した色素標識を測定することによりなされるか;又は
前記基質化合物又はその塩におけるリシン残基のεアミノ基がメチル化されて、アミド結合がペプチダーゼによって切断されなかった色素標識を測定することによりなされる;
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
次の(a)~(e)の工程を含むことを特徴とする、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法;
(a)以下の一般式(I)
【化2】
 


(一般式(I)中、R1は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Xは0又は1個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Kはリシン残基を示し、R2はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、R2は、4-メチルクマリル-7-アミド基、2-アミノナフタレン-6-スルホン酸基、4-クロロメチルクマリル-7-アミド基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミド基、2-アミノ-7-メチルプリン-6-チオール基、ローダミン110基、ローダミン110モノアミド基、p-ニトロアニリド基及びβ-アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。)で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下する基質化合物又はその塩を準備する工程;
(b)前記一般式(I)で表される基質化合物又はその塩と、ヒストンメチル化酵素とを、被検化合物の存在下、ヒストンメチル化酵素によるメチル化反応に必要な条件下で接触させる工程;
(c)工程(b)の後、前記基質化合物又はその塩にペプチダーゼを作用させる工程;
(d)工程(c)の後、前記色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化の程度を測定することにより、前記基質化合物又はその塩を基質とするペプチダーゼの切断活性の低下の程度に基づき、基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度を算出する工程;及び、
(e)工程(d)における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度が、被検化合物の非存在下における基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇の程度と比較して、少ない被検化合物を選択する工程。

【請求項4】
 
ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも1種のペプチダーゼである請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
以下の一般式(I)
【化3】
 


(一般式(I)中、R1は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Xは0又は1個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Kはリシン残基を示し、R2はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、R2は、4-メチルクマリル-7-アミド基、2-アミノナフタレン-6-スルホン酸基、4-クロロメチルクマリル-7-アミド基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミド基、2-アミノ-7-メチルプリン-6-チオール基、ローダミン110基、ローダミン110モノアミド基、p-ニトロアニリド基及びβ-アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。)で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩。

【請求項6】
 
ヒストンメチル化酵素が、X-Kからなるペプチドの配列に応じた基質特異性を有するヒストンメチル化酵素であり、基質化合物又はその塩におけるX-Kからなるペプチドの配列が、該ヒストンメチル化酵素に対して基質特異性を示す配列であることを特徴とする請求項5に記載の基質化合物又はその塩。

【請求項7】
 
以下の(a)及び(b)の要素を含む、ヒストンメチル化酵素活性の測定用試薬キット;
(a)以下の一般式(I)
【化4】
 


(一般式(I)中、R1は水素原子又はアミノ末端の保護基を示し、Xは0又は1個以上のアミノ酸残基からなるペプチドを示し、Kはリシン残基を示し、R2はリシン残基のカルボニル末端にアミド結合した色素標識を示し、R2は、4-メチルクマリル-7-アミド基、2-アミノナフタレン-6-スルホン酸基、4-クロロメチルクマリル-7-アミド基、4-トリフルオロメチルクマリル-7-アミド基、2-アミノ-7-メチルプリン-6-チオール基、ローダミン110基、ローダミン110モノアミド基、p-ニトロアニリド基及びβ-アミノナフタレン基からなる群から選ばれるいずれかの基を示す。)で表される基質化合物又はその塩であって、
前記アミド結合がペプチダーゼによって切断されると、色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化し、また、前記リシン残基のεアミノ基が前記ヒストンメチル化酵素によりメチル化されると、ペプチダーゼに対する感受性が低下するヒストンメチル化酵素活性測定用の基質化合物又はその塩;及び、
(b)前記一般式(I)で表される基質化合物又はその塩を切断するペプチダーゼであって、該ペプチダーゼは基質化合物又はその塩のメチル化レベルの上昇に伴って切断活性が低下するペプチダーゼ。

【請求項8】
 
ペプチダーゼが、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼLys-C、プラスミン、カルパイン、及び、トリプシンからなる群から選択される少なくとも1種のペプチダーゼである請求項7に記載の試薬キット。

【請求項9】
 
請求項7又は8に記載の試薬キットと、ヒストンメチル化酵素とを含む、ヒストンメチル化酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング用キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

※Click image to enlarge.

JP2010202484thum.jpg
State of application right Registered
Please contact us by E-mail or facsimile if you have any interests on this patent.


PAGE TOP

close
close
close
close
close
close
close