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LINKER COMPOUND, LIGAND, OLIGOSACCHARIDE CHAIN FIXING METHOD AND SUPPORT FOR ANALYZING PROTEIN achieved

Patent code P110002903
File No. Y01-P272
Posted date Jun 8, 2011
Application number P2001-280672
Publication number P2003-083969A
Patent number P3847591
Date of filing Sep 14, 2001
Date of publication of application Mar 19, 2003
Date of registration Sep 1, 2006
Inventor
  • (In Japanese)隅田 泰生
  • (In Japanese)楠本 正一
  • (In Japanese)荒野 明男
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title LINKER COMPOUND, LIGAND, OLIGOSACCHARIDE CHAIN FIXING METHOD AND SUPPORT FOR ANALYZING PROTEIN achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a linker compound capable of simply fixing an oligosaccharide chain to the surface of a support for analyzing protein in one stage using an oligosaccharide of every kind isolated from the natural world and obtained by refining as it is and capable of obtaining the support for analyzing protein reduced in the effect due to non-specific interaction based on the hydrophobic interaction with protein analyzed using the support for analyzing protein and capable of continuously and quantitatively evaluating the coupling interaction with protein of every kind.
SOLUTION: The linker compound has a structure represented by formula (1) and can fix the oligosaccharide chain in a ligand to the surface of the support for analyzing protein by an S-Au bond in one stage.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


下記一般式(6)



【化6】




で表される硫酸化多糖ヘパリンは、構造や分子量が非常に不均一なものであり、多くの生物活性を有することが知られている。そのなかでも、抗血液凝固活性は有名であり、医薬として広く用いられている。



しかしながら、不均一な硫酸化多糖ヘパリンは、血小板やフォンビルブラント因子(vWF)とも結合する。このため、従来、硫酸化多糖ヘパリンを医薬として用いた場合における血液中の血小板との結合に起因する副作用が指摘されている。



これらの結合相互作用には、硫酸化多糖ヘパリン中の、下記一般式(7)



【化7】




で表される特定の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)と、それに基づくクラスタリング効果が重要である。



本願発明者等は、以前に、この特定の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)が血小板細胞や血液凝固に関わるフォンビルブラント因子(vWF)という蛋白質との結合に大きく関与することを見出した。



しかしながら、これらの生化学的結合実験のためには特殊な設備や多量のオリゴ糖が必要になるという問題がある。生物活性測定法としては、従来、放射標識法(RI法)とSPR法とが知られているが、RI法は、特殊な実験設備や多量のオリゴ糖を必要とする。



そこで、本願発明者等は、蛋白質分析用の支持体として非放射標識法である表面プラズモン共鳴(SPR)のセンサチップを使用し、図11に示すように、該センサチップの表面上に、疎水性相互作用を介して上記した部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)を固定化し、SPRを用いて硫酸化多糖ヘパリン中の部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)と硫酸化多糖ヘパリン結合性の蛋白質との結合挙動を解析した。SPR法は、少量のオリゴ糖で測定が可能であり、分子間の相互作用をリアルタイムで観測することが可能である。なお、図11中、NS6Sは上記した部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)のうちGlcNS6Sを示し、I2SはIdoA2Sを示し、Gはグルコース単位を示す。



具体的には、センサチップとしての疎水性チップ上に上記部分二糖構造(GlcNS6S-IdoA2S)を固定化し、この疎水性チップ上に、硫酸化多糖ヘパリン結合性ドメインを有する合成vWFペプチド(vWF中のヘパリン結合サイト;YIGLKDRKRPSELRRIASQVKYA-NH)をアナライトとして添加した。



この結果、図12の線aに示すように、vWFペプチドの濃度変化に応じて結合量の変化、すなわち、ΔRU1 (オリゴ糖の結合量)/ΔRU2 (vWFペプチドの結合量)が観測された。



この線aのカーブから求められる解離定数KD は、以前にSobel等が生化学的手法を用いて測定(M.Sobel et al. J. Biol. Chem. (1992), vol.267, p8857 、KD = 370±100nM)した値にオーダーとして近いものであった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、オリゴ糖鎖を、表面プラズモン共鳴等のセンサチップやアフィニティークロマトグラフィの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物および該リンカー化合物を用いたリガンド並びに該リガンドを用いたオリゴ糖鎖の固定化方法および該リガンドを表面に固定化させてなる蛋白質分析用の支持体に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
一般式(4)
【化4】
 


で表される構造を有し、ヘパリン結合性蛋白質との結合挙動の解析に用いられるリガンド。

【請求項2】
 
オリゴ糖鎖をヘパリン結合性蛋白質分析用の支持体の表面に固定化するオリゴ糖鎖の固定化方法であって、
請求項1記載のリガンドを含む溶液と、表面に金を有する支持体とを接触させることを特徴とするオリゴ糖鎖の固定化方法。

【請求項3】
 
請求項1記載のリガンドを、S-Au結合を介して表面に固定化させてなることを特徴とするヘパリン結合性蛋白質分析用の支持体。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2001280672thum.jpg
State of application right Registered
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