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ENZYMATIC EVOLUTION METHOD USING UNILAMELLAR LIPOSOME

Patent code P110002946
File No. E102P04
Posted date Jun 9, 2011
Application number P2011-076727
Publication number P2012-210170A
Patent number P5467320
Date of filing Mar 30, 2011
Date of publication of application Nov 1, 2012
Date of registration Feb 7, 2014
Inventor
  • (In Japanese)四方 哲也
  • (In Japanese)市橋 伯一
  • (In Japanese)角南 武志
  • (In Japanese)西川 雄大
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title ENZYMATIC EVOLUTION METHOD USING UNILAMELLAR LIPOSOME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To improve screening efficiency in molecular-evolutional engineering technique (for example, enzymatic evolution).
SOLUTION: There is provided unilamellar liposomes such as a nuclease-treated unilamellar liposome comprising: (a) a DNA comprising a promoter sequence, a translational initiator sequence, and a polypeptide-encoding sequence; (b) an RNA polymerase; (c) a ribonucleotide; and (d) an acellular protein synthesis system, or a nuclease-treated unilamellar liposome comprising (a) an RNA comprising a translational initiator sequence and a polypeptide-encoding sequence, and (d) an acellular protein synthesis system.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



酵素を進化工学的に改良する方法として、遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系を封入したリポソームとセルソータを用いた方法が利用されている。この方法では、酵素遺伝子にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーと無細胞蛋白質合成系をリポソームに封入し、内部で酵素を発現させる。そして、セルソータにより、より高機能の酵素を含むリポソームを選択することにより、より高機能の酵素をコードする遺伝子を選択することができる。この選択を繰り返すことによって、酵素をコードする遺伝子を進化させることができる(非特許文献1)。





スクリーニング効率を向上させることによって、より少ない作業量で、より高い機能を有する酵素をコードする遺伝子が可能になると予測される。それゆえ、酵素進化法におけるスクリーニング効率の向上が求められている。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、分子進化工学に利用するための、新規の一枚膜リポソームの分野に関連する。また、本発明は、一枚膜リポソームを用いた、新規の分子進化工学、特に、酵素進化工学に関連する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項2】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項3】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項1に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項4】
 
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。

【請求項5】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項4に記載のライブラリー。

【請求項6】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項4に記載のライブラリー。

【請求項7】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームであって、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、一枚膜リポソーム。

【請求項8】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項9】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項7に記載の一枚膜リポソーム。

【請求項10】
 
核酸分解酵素によって処理された複数の一枚膜リポソームを含むライブラリーであって、該複数の一枚膜リポソームの各々は、以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を含む、ライブラリー。

【請求項11】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項10に記載のライブラリー。

【請求項12】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項10に記載のライブラリー。

【請求項13】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)プロモーター配列、翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むDNA;
(b)RNAポリメラーゼ;
(c)リボヌクレオチド;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項14】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。

【請求項15】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項13に記載の方法。

【請求項16】
 
核酸分解酵素によって処理された一枚膜リポソームの製造方法であって、以下:
(1)以下:
(a)翻訳開始配列、および、ポリペプチドコード配列を含むRNA;ならびに、
(d)無細胞蛋白質合成系、
を封入した一枚膜リポソームを調製する工程;ならびに、
(2)工程(1)で調製された一枚膜リポソームを、核酸分解酵素によって処理する工程、
を包含する、方法。

【請求項17】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素、および、DNA分解酵素からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。

【請求項18】
 
前記核酸分解酵素が、RNA分解酵素である、請求項16に記載の方法。

【請求項19】
 
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項4に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるDNAを増幅する工程;および、
(iv)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。

【請求項20】
 
一枚膜リポソームのライブラリーを用いたスクリーニング方法であって、以下:
(i)請求項10に記載のライブラリーを提供する工程;
(ii)該ライブラリーから、所望の特徴を有する一枚膜リポソームを選択する工程;
(iii)該一枚膜リポソームに含まれるRNAに逆転写酵素を作用させて、DNAを生成する工程;
(iv)該生成したDNAを増幅する工程;および、
(v)該増幅したDNAを単離する工程、
を包含する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2011076727thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) ERATO YOMO Dynamical Micro-scale Reaction Environment AREA
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